Twist基因誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的:絨毛膜癌(choriocarcinoma)簡稱絨癌(CC)，在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中(gestational trophoblastic disease，GTD)惡性程度居于首位。其可繼發(fā)于包括足月分娩、異位妊娠、自然流產(chǎn)以及葡萄胎在內(nèi)的各種類型的妊娠。絨癌在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率雖不及宮頸癌、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌，但其發(fā)展迅速，早期即可轉(zhuǎn)移至肺、腦等重要臟器，惡性程度極高，嚴(yán)重危害著廣大女性的生命健康。因其對化療藥物極其敏感，絨癌成

2、為首個(gè)能夠通過化療治愈的婦科實(shí)體腫瘤。但由于化療藥物種類及化療方案的選擇不當(dāng)，常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的情形產(chǎn)生，使之成為化療失敗的最主要原因。滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)病與多方面因素有關(guān)，發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此關(guān)于其發(fā)生、發(fā)展及耐藥方面的研究一直是人們廣泛關(guān)注的話題?，F(xiàn)已證實(shí)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)與多種上皮性惡性腫瘤的局部浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Twist基因是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(

3、basicHelix-Loop-Helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，1983年被Thisse等在研究果蠅胚胎發(fā)育時(shí)初次發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中Twist基因的過度表達(dá)非常常見。在對多種腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Twist基因是腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，并獲得遷徙、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的主要誘導(dǎo)因子之一。本研究探討Twist基因在人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞中的過表達(dá)對絨癌細(xì)胞增殖能力及對上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物

4、N-cadherin的影響，說明Twist基因在絨癌發(fā)生發(fā)展中的作用，從另一方面闡明絨癌的發(fā)病機(jī)制，為絨癌的早期診斷和治療提供更可靠的理論依據(jù)，以期制定個(gè)性化治療方案。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞株于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，使其保持良好的細(xì)胞生長狀態(tài);
　　2、分組:(1)實(shí)驗(yàn)組—轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Twist特異性質(zhì)粒;(2)陰性對照組—轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒;(3)脂質(zhì)體對照組—轉(zhuǎn)染

5、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑;(4)空白對照組—常規(guī)培養(yǎng)不予轉(zhuǎn)染;
　　3、倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的形態(tài)變化;
　　4、CCK-8法檢測0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)及96小時(shí)實(shí)驗(yàn)組和各對照組JEG-3細(xì)胞的增殖速度;
　　5、Realtime-qPCR法檢測各組人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后Twist-mRNA的表達(dá)水平;
　　6、Western blot方法檢測

6、轉(zhuǎn)染48小時(shí)后各組人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin的表達(dá)量;
　　7、統(tǒng)計(jì)方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)以(x)±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間差異選用SNK/LSD法，以P＜0.05表示差異具有顯著性，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:JEG-3細(xì)胞呈圓形或多邊形生長，細(xì)胞輪

7、廓清晰，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)呈多角形或不規(guī)則形，大片狀生長，邊界不清。
　　2、CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖能力:
　　0小時(shí):實(shí)驗(yàn)組0.143±0.003，陰性對照組0.138±0.003，脂質(zhì)體對照組0.143±0.003，空白對照組0.139±0.002，各組之間相比P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即各組細(xì)胞增殖能力相近;
　　24小時(shí):實(shí)驗(yàn)組0.248±0.002與陰性對照組0.244±0.007相比P＞0

8、.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增殖能力相似;實(shí)驗(yàn)組0.248±0.002與脂質(zhì)體對照組0.193±0.004及空白對照組0.221±0.010相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)組增殖能力較快;
　　48小時(shí):陰性對照組0.417±0.003，脂質(zhì)體對照組0.407±0.011，空白對照組0.418±0.009相比P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增殖能力相近;而實(shí)驗(yàn)組0.515±0.002增殖能力明顯高于其余3個(gè)對照組，P＜0

9、.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　72小時(shí):細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)組0.988±0.021＞空白對照組0.781±0.016＞陰性對照組0.617±0.003＞脂質(zhì)體對照組0.515±0.013，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　96小時(shí):各組細(xì)胞增殖趨勢與72小時(shí)相似，實(shí)驗(yàn)組1.411±0.005＞空白對照組1.293±0.003＞陰性對照組1.163±0.006＞脂質(zhì)體對照組0.801±0.005，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義。
　　3、Realtime-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后Twist-mRNA的表達(dá)水平:實(shí)驗(yàn)組2.074±0.025;陰性對照組1.093±0.011;脂質(zhì)體對照組1.055±0.025;空白對照組1.002±0.021;實(shí)驗(yàn)組分別與陰性對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)組Twist-mRNA表達(dá)量明顯升高。陰性對照組與脂質(zhì)體對照組Twist-mRNA的表達(dá)量對比P＞0.0

11、5，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、Western-blot方法檢測各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)情況:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，各組細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)為:實(shí)驗(yàn)組0.273±0.045，陰性對照組0.645±0.020，脂質(zhì)體對照組0.594±0.031，空白對照組0.390±0.034;實(shí)驗(yàn)組與各對照組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組較其他對照組組明顯降低;各組細(xì)胞N-cadherin的表

12、達(dá)為:實(shí)驗(yàn)組0.679±0.032，陰性對照組0.578±0.030，脂質(zhì)體對照組0.576±0.013，空白對照組0.581±0.020;實(shí)驗(yàn)組與各對照組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)組較陰性對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組N-cadherin表達(dá)顯著升高。而3個(gè)對照組之間兩兩比較，P＞0.05，E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白表達(dá)量均無顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1、Twist基因過表達(dá)