乳酸誘導肺腺癌細胞上皮間質(zhì)轉化的機制研究.pdf

1、背景與目的:調(diào)查研究表明肺癌是全球發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤，目前來說相對的5年生存率僅為18％，造成肺癌患者遠期生存率較低的主要原因是腫瘤侵襲及轉移，研究數(shù)據(jù)表明，約80-90%的肺癌患者的死亡是由腫瘤的轉移引起的，因此，探討肺癌侵襲轉移的具體機制并采取相應的預防、治療措施具有重大的臨床意義和社會意義。肺癌侵襲轉移是一個連續(xù)、漸進的涉及多基因并且有諸多步驟的動態(tài)過程，可能涉及到多個細胞信號通路的改變和關鍵基因結構、功能的異常。近

2、年研究表明在腫瘤有氧糖酵解過程中，乳酸的不斷積累與腫瘤的轉移有密切的關系，而上皮間質(zhì)轉化作為腫瘤轉移的一個早期事件可能會受到乳酸積累的影響，所以本研究就乳酸對腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉化的影響進行探討，進而研究乳酸對腫瘤轉移的影響。有研究表明，上皮間質(zhì)轉化的過程受幾種關鍵轉錄因子的調(diào)節(jié)，轉錄因子Snail是已知可以調(diào)節(jié)上皮細胞標志蛋白的一個關鍵因子，因此本研究進一步探討了乳酸是否通過影響轉錄因子Snail的表達來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉化的發(fā)生。本文旨在

3、深入研究乳酸和上皮間質(zhì)轉化的聯(lián)系及其分子機制，有利于進一步闡明腫瘤轉移的分子機制，從而為腫瘤治療提供新的靶點和思路。
　　材料與方法:選取人非小細胞腺癌細胞株H1299作為研究對象。?采用Transwell小室實驗研究乳酸對H1299細胞株遷徙能力的影響，統(tǒng)計穿過ECM膜的細胞數(shù)目，進行統(tǒng)計分析，繪制柱狀圖。?用不同濃度的乳酸（5、10、15、20、30mM）刺激H1299細胞，通過Western blotting方法檢測EMT分

4、子標志蛋白的變化，應用ImageJ軟件計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值，統(tǒng)計分析后繪制蛋白灰度比值的柱形圖。?在H1299細胞內(nèi)轉染LDHA siRNA,隨后用Western blotting檢測轉染效率及EMT標志物的變化，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值并繪制蛋白灰度比值的柱形圖。?在H1299細胞外,用不同濃度乳酸對其進行刺激，應用Western blotting方法檢測細胞內(nèi)Snail的變化?通過RNA干擾的方法沉默糖酵

5、解關鍵酶LDHA，利用Western blotting檢測轉染效率及轉染前后Snail的變化。?沉默轉錄因子Snail的表達后，通過Western blotting檢測Snail表達沉默前后H1299細胞在乳酸作用下EMT標志物蛋白水平的變化。
　　結果:
　　1、20mM乳酸處理組較10mM組H1299細胞穿透ECM膜的細胞數(shù)量增多，差異具有統(tǒng)計學意義（p=0.016）
　　2、5,10,15,20,30mM乳酸處理

6、H1299細胞后，細胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達下調(diào)，F(xiàn)ibronectin表達上調(diào)，且各自的蛋白灰度比值與0mM對照組相比具有統(tǒng)計學差異，且兩兩相比，差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　3、LDHA siRNA轉染H1299細胞后，LDHA蛋白較對照組表達水平下降，上皮標志蛋白E-cadherin的表達水平較對照組上調(diào)且兩者灰度比值差異都具有統(tǒng)計學意義（p=0.000,0.000）。
　　4、5、10、15、20、30mM乳酸

7、處理H1299細胞后,轉錄因子Snail表達上調(diào)，且各自的蛋白灰度比值與0mM對照組相比具有統(tǒng)計學差異（p＜0.05），且兩兩相比差異均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。用LDHA siRNA轉染H1299細胞后，與對照組相比LDHA蛋白和Snail蛋白表達均下降且灰度比值差異都具有統(tǒng)計學意義（p=0.000,0.000）。
　　5、10mM乳酸處理后，Snail siRNA組和NT siRNA組相比Snail蛋白表達下調(diào)且灰度比值

8、具有顯著差異性（p=0.000）;E-cadherin蛋白表達上調(diào)且灰度比值具有統(tǒng)計學意義（p=0.000）;Fibronectin蛋白表達下降且灰度比值具有統(tǒng)計學意義（p=0.000）。
　　結論:
　　1、乳酸可以促進H1299細胞的體外遷徙能力，隨著乳酸濃度增加細胞體外遷徙能力增加，二者呈正比關系。
　　2、在H1299細胞內(nèi)和細胞外乳酸均可以誘導EMT上皮細胞標志物的表達下降和間質(zhì)細胞標志物的表達上調(diào)，說明乳酸