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文檔簡介
1、背景與目的:調(diào)查研究表明肺癌是全球發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤,目前來說相對的5年生存率僅為18%,造成肺癌患者遠期生存率較低的主要原因是腫瘤侵襲及轉移,研究數(shù)據(jù)表明,約80-90%的肺癌患者的死亡是由腫瘤的轉移引起的,因此,探討肺癌侵襲轉移的具體機制并采取相應的預防、治療措施具有重大的臨床意義和社會意義。肺癌侵襲轉移是一個連續(xù)、漸進的涉及多基因并且有諸多步驟的動態(tài)過程,可能涉及到多個細胞信號通路的改變和關鍵基因結構、功能的異常。近
2、年研究表明在腫瘤有氧糖酵解過程中,乳酸的不斷積累與腫瘤的轉移有密切的關系,而上皮間質(zhì)轉化作為腫瘤轉移的一個早期事件可能會受到乳酸積累的影響,所以本研究就乳酸對腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉化的影響進行探討,進而研究乳酸對腫瘤轉移的影響。有研究表明,上皮間質(zhì)轉化的過程受幾種關鍵轉錄因子的調(diào)節(jié),轉錄因子Snail是已知可以調(diào)節(jié)上皮細胞標志蛋白的一個關鍵因子,因此本研究進一步探討了乳酸是否通過影響轉錄因子Snail的表達來調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉化的發(fā)生。本文旨在
3、深入研究乳酸和上皮間質(zhì)轉化的聯(lián)系及其分子機制,有利于進一步闡明腫瘤轉移的分子機制,從而為腫瘤治療提供新的靶點和思路。
材料與方法:選取人非小細胞腺癌細胞株H1299作為研究對象。?采用Transwell小室實驗研究乳酸對H1299細胞株遷徙能力的影響,統(tǒng)計穿過ECM膜的細胞數(shù)目,進行統(tǒng)計分析,繪制柱狀圖。?用不同濃度的乳酸(5、10、15、20、30mM)刺激H1299細胞,通過Western blotting方法檢測EMT分
4、子標志蛋白的變化,應用ImageJ軟件計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值,統(tǒng)計分析后繪制蛋白灰度比值的柱形圖。?在H1299細胞內(nèi)轉染LDHA siRNA,隨后用Western blotting檢測轉染效率及EMT標志物的變化,計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白之間的灰度比值并繪制蛋白灰度比值的柱形圖。?在H1299細胞外,用不同濃度乳酸對其進行刺激,應用Western blotting方法檢測細胞內(nèi)Snail的變化?通過RNA干擾的方法沉默糖酵
5、解關鍵酶LDHA,利用Western blotting檢測轉染效率及轉染前后Snail的變化。?沉默轉錄因子Snail的表達后,通過Western blotting檢測Snail表達沉默前后H1299細胞在乳酸作用下EMT標志物蛋白水平的變化。
結果:
1、20mM乳酸處理組較10mM組H1299細胞穿透ECM膜的細胞數(shù)量增多,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.016)
2、5,10,15,20,30mM乳酸處理
6、H1299細胞后,細胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達下調(diào),F(xiàn)ibronectin表達上調(diào),且各自的蛋白灰度比值與0mM對照組相比具有統(tǒng)計學差異,且兩兩相比,差異均具有統(tǒng)計學意義。
3、LDHA siRNA轉染H1299細胞后,LDHA蛋白較對照組表達水平下降,上皮標志蛋白E-cadherin的表達水平較對照組上調(diào)且兩者灰度比值差異都具有統(tǒng)計學意義(p=0.000,0.000)。
4、5、10、15、20、30mM乳酸
7、處理H1299細胞后,轉錄因子Snail表達上調(diào),且各自的蛋白灰度比值與0mM對照組相比具有統(tǒng)計學差異(p<0.05),且兩兩相比差異均具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。用LDHA siRNA轉染H1299細胞后,與對照組相比LDHA蛋白和Snail蛋白表達均下降且灰度比值差異都具有統(tǒng)計學意義(p=0.000,0.000)。
5、10mM乳酸處理后,Snail siRNA組和NT siRNA組相比Snail蛋白表達下調(diào)且灰度比值
8、具有顯著差異性(p=0.000);E-cadherin蛋白表達上調(diào)且灰度比值具有統(tǒng)計學意義(p=0.000);Fibronectin蛋白表達下降且灰度比值具有統(tǒng)計學意義(p=0.000)。
結論:
1、乳酸可以促進H1299細胞的體外遷徙能力,隨著乳酸濃度增加細胞體外遷徙能力增加,二者呈正比關系。
2、在H1299細胞內(nèi)和細胞外乳酸均可以誘導EMT上皮細胞標志物的表達下降和間質(zhì)細胞標志物的表達上調(diào),說明乳酸
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