Slug基因誘導(dǎo)絨癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的：絨毛膜癌，簡(jiǎn)稱(chēng)絨癌（choriocarcinoma，CC），是妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN）的一種，惡性程度極高，可繼發(fā)于葡萄胎妊娠、流產(chǎn)、足月妊娠、異位妊娠，其特點(diǎn)是滋養(yǎng)細(xì)胞失去了原有的絨毛結(jié)構(gòu)，而散在地侵入肌層，發(fā)生局部轉(zhuǎn)移，生長(zhǎng)迅速，早期即可通過(guò)血液轉(zhuǎn)移至肺、腦等重要器官。因其對(duì)化療藥物極其敏感，使大部分患者能夠通過(guò)化療治愈，但耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響著我們攻克

2、絨毛膜癌的進(jìn)程。本文對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在絨癌轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行研究。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指某些特定部位的上皮細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)學(xué)特征的改變，使其在生物學(xué)上更適合侵襲和轉(zhuǎn)移，近年來(lái)大量實(shí)驗(yàn)證明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與多種上皮惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。而Slug作為鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是EMT重要的調(diào)節(jié)因

3、子，通過(guò)與E-cadherin的E-box結(jié)合抑制其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞間緊密連接遭到破壞，從而誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將Slug基因轉(zhuǎn)染人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞，使其在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，觀(guān)察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)記物的E-cadherin、N-cadherin的表達(dá)水平，闡述絨癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為絨癌的治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞株，在溫度為37℃，

4、CO2濃度為5％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
　　2.實(shí)驗(yàn)分組：①實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Slug質(zhì)粒；②陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染不含目的基因的空白質(zhì)粒；③脂質(zhì)體對(duì)照組，轉(zhuǎn)染時(shí)加入Lipofectamine(TM)2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑；④空白對(duì)照組，常規(guī)培養(yǎng)，無(wú)轉(zhuǎn)染處理；
　　3.顯微鏡觀(guān)察各個(gè)實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的變化；
　　4.CCK-8法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、空白對(duì)照組在0h、24h、48h、72h、96

5、h時(shí)的增殖情況；
　　5.Realtime-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，細(xì)胞中Slug-mRNA的表達(dá)水平；
　　6.Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞中 E-cadherin及N-cadherin表達(dá)情況
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。統(tǒng)計(jì)前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢

6、驗(yàn)，對(duì)于正態(tài)、方差齊的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異采用LSD/SNK法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.人絨毛膜細(xì)胞JEG-3細(xì)胞形態(tài)的觀(guān)察
　　顯微鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞形態(tài)，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、陰性對(duì)照組細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞膜完整，呈片狀生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭形或多角形，細(xì)胞排列松散

7、。
　　2.轉(zhuǎn)染效率的觀(guān)察
　　使用Lipofectamine?2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞，熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組在轉(zhuǎn)染24及48小時(shí)后后轉(zhuǎn)染效率分別為15-20%、70-80%。脂質(zhì)體對(duì)照組及空白對(duì)照組無(wú)熒光表達(dá)。
　　3.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況
　　0小時(shí)：實(shí)驗(yàn)組0.142±0.007，陰性對(duì)照組0.138±0.003，脂質(zhì)體對(duì)照組0.143±0.003，空白對(duì)照組0

8、.139±0.002，各組間比較P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組增殖速度無(wú)差異；
　　24小時(shí)：實(shí)驗(yàn)組0.247±0.004，陰性對(duì)照組0.244±0.007，脂質(zhì)體對(duì)照組0.193±0.004，空白對(duì)照組0.221±0.010，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組與另外兩個(gè)對(duì)照組（脂質(zhì)體、空白對(duì)照組）相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組增殖速率較空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組快；
　　4

9、8小時(shí)：實(shí)驗(yàn)組0.509±0.004，陰性對(duì)照組0.417±0.003，脂質(zhì)體對(duì)照組0.407±0.011，空白對(duì)照組0.418±0.009，實(shí)驗(yàn)組與其他三組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組增殖速率較其他三組快；
　　72小時(shí)：實(shí)驗(yàn)組0.977±0.019，陰性對(duì)照組0.617±0.003，脂質(zhì)體對(duì)照組0.515±0.013，空白對(duì)照組0.781±0.016，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、空白對(duì)照組三組相比P＜0.0

10、5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明轉(zhuǎn)染后72小時(shí)實(shí)驗(yàn)組增殖速率較其他三組快；
　　96小時(shí)：實(shí)驗(yàn)組1.371±0.023，陰性對(duì)照組1.163±0.006，脂質(zhì)體對(duì)照組0.801±0.005，空白對(duì)照組1.293±0.003，實(shí)驗(yàn)組與其他三組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組增殖速率較其他三組快。
　　4. Realtime-qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及各對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后， Slug-mRNA的表達(dá)水平：
　　實(shí)驗(yàn)組2

11、.070±0.028，陰性對(duì)照組1.093±0.011，脂質(zhì)體對(duì)照組1.055±0.025，空白對(duì)照組1.002±0.021，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、空白對(duì)照組三組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組Slug-mRNA的表達(dá)量較其他三組升高，實(shí)現(xiàn)了目的基因的高表達(dá)。
　　5. Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞中E-cadherin及N-cadherin表達(dá)情況：
　　各組 E蛋

12、白表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組為0.302±0.016，陰性對(duì)照組為0.645±0.020，脂質(zhì)體對(duì)照組為0.594±0.031，空白對(duì)照組為0.390±0.034,實(shí)驗(yàn)組E-cadherin的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯下調(diào)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　各組N-cadherin的表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組為0.672±0.037，陰性對(duì)照組為0.578±0.030，脂質(zhì)體對(duì)照組為0.576±0.013，空白對(duì)照組為0.

13、581±0.020。實(shí)驗(yàn)組N-cadherin的表達(dá)水平較陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯上調(diào)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.Slug基因的高表達(dá)能夠改變絨癌JEG-3細(xì)胞學(xué)形態(tài)，使其更符合間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征，從而使其惡性侵襲力增強(qiáng)。
　　2.Slug基因的高表達(dá)能夠提高絨癌JEG-3細(xì)胞的增殖速率，從而加速其臨床進(jìn)程。
　　3.Slug基因的高表達(dá)能夠使絨癌JEG-3細(xì)胞E-ca