Slug基因誘導絨癌細胞上皮-間質(zhì)轉化的研究.pdf

1、目的：絨毛膜癌，簡稱絨癌（choriocarcinoma，CC），是妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN）的一種，惡性程度極高，可繼發(fā)于葡萄胎妊娠、流產(chǎn)、足月妊娠、異位妊娠，其特點是滋養(yǎng)細胞失去了原有的絨毛結構，而散在地侵入肌層，發(fā)生局部轉移，生長迅速，早期即可通過血液轉移至肺、腦等重要器官。因其對化療藥物極其敏感，使大部分患者能夠通過化療治愈，但耐藥性的產(chǎn)生嚴重影響著我們攻克

2、絨毛膜癌的進程。本文對上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在絨癌轉移機制進行研究。上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指某些特定部位的上皮細胞所發(fā)生的形態(tài)學特征的改變，使其在生物學上更適合侵襲和轉移，近年來大量實驗證明上皮-間質(zhì)轉化參與多種上皮惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。而Slug作為鋅指轉錄因子家族成員之一，是EMT重要的調(diào)節(jié)因

3、子，通過與E-cadherin的E-box結合抑制其細胞內(nèi)轉錄，導致細胞間緊密連接遭到破壞，從而誘導上皮-間質(zhì)轉化的發(fā)生，本實驗通過將Slug基因轉染人絨毛膜癌JEG-3細胞，使其在細胞中過表達，觀察轉染后的細胞增殖能力及上皮-間質(zhì)轉化相關標記物的E-cadherin、N-cadherin的表達水平，闡述絨癌的發(fā)生發(fā)展機制，為絨癌的治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)：人絨毛膜癌JEG-3細胞株，在溫度為37℃，

4、CO2濃度為5％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
　　2.實驗分組：①實驗組，轉染pEGFP-N1-Slug質(zhì)粒；②陰性對照組，轉染不含目的基因的空白質(zhì)粒；③脂質(zhì)體對照組，轉染時加入Lipofectamine(TM)2000脂質(zhì)體轉染試劑；④空白對照組，常規(guī)培養(yǎng)，無轉染處理；
　　3.顯微鏡觀察各個實驗組轉染后細胞形態(tài)的變化；
　　4.CCK-8法檢測實驗組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組、空白對照組在0h、24h、48h、72h、96

5、h時的增殖情況；
　　5.Realtime-PCR檢測實驗組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組、空白對照組細胞轉染48小時后，細胞中Slug-mRNA的表達水平；
　　6.Western blot檢測各組細胞轉染48小時后細胞中 E-cadherin及N-cadherin表達情況
　　7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，本實驗數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。統(tǒng)計前對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性及方差齊性檢

6、驗，對于正態(tài)、方差齊的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異采用LSD/SNK法。檢驗水準α＝0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P>0.05差異無統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.人絨毛膜細胞JEG-3細胞形態(tài)的觀察
　　顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)，空白對照組、脂質(zhì)體對照組、陰性對照組細胞呈圓形或橢圓形，胞膜完整，呈片狀生長；轉染后的細胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭形或多角形，細胞排列松散

7、。
　　2.轉染效率的觀察
　　使用Lipofectamine?2000脂質(zhì)體轉染法轉染JEG-3細胞，熒光顯微鏡觀察細胞轉染效率。實驗組及陰性對照組在轉染24及48小時后后轉染效率分別為15-20%、70-80%。脂質(zhì)體對照組及空白對照組無熒光表達。
　　3.CCK-8法檢測細胞增殖情況
　　0小時：實驗組0.142±0.007，陰性對照組0.138±0.003，脂質(zhì)體對照組0.143±0.003，空白對照組0

8、.139±0.002，各組間比較P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，各組增殖速度無差異；
　　24小時：實驗組0.247±0.004，陰性對照組0.244±0.007，脂質(zhì)體對照組0.193±0.004，空白對照組0.221±0.010，實驗組與陰性對照組相比，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，實驗組與另外兩個對照組（脂質(zhì)體、空白對照組）相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明實驗組增殖速率較空白對照組、脂質(zhì)體對照組快；
　　4

9、8小時：實驗組0.509±0.004，陰性對照組0.417±0.003，脂質(zhì)體對照組0.407±0.011，空白對照組0.418±0.009，實驗組與其他三組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，實驗組增殖速率較其他三組快；
　　72小時：實驗組0.977±0.019，陰性對照組0.617±0.003，脂質(zhì)體對照組0.515±0.013，空白對照組0.781±0.016，實驗組與陰性對照組、脂質(zhì)體對照組、空白對照組三組相比P＜0.0

10、5，差異有統(tǒng)計學意義，說明轉染后72小時實驗組增殖速率較其他三組快；
　　96小時：實驗組1.371±0.023，陰性對照組1.163±0.006，脂質(zhì)體對照組0.801±0.005，空白對照組1.293±0.003，實驗組與其他三組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，實驗組增殖速率較其他三組快。
　　4. Realtime-qPCR檢測實驗組及各對照組細胞轉染48小時后， Slug-mRNA的表達水平：
　　實驗組2

11、.070±0.028，陰性對照組1.093±0.011，脂質(zhì)體對照組1.055±0.025，空白對照組1.002±0.021，實驗組與陰性對照組、脂質(zhì)體對照組、空白對照組三組相比P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，說明轉染后實驗組Slug-mRNA的表達量較其他三組升高，實現(xiàn)了目的基因的高表達。
　　5. Western blot檢測各組細胞轉染48小時后細胞中E-cadherin及N-cadherin表達情況：
　　各組 E蛋

12、白表達水平：實驗組為0.302±0.016，陰性對照組為0.645±0.020，脂質(zhì)體對照組為0.594±0.031，空白對照組為0.390±0.034,實驗組E-cadherin的表達水平較陰性對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組明顯下調(diào)，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　各組N-cadherin的表達水平：實驗組為0.672±0.037，陰性對照組為0.578±0.030，脂質(zhì)體對照組為0.576±0.013，空白對照組為0.

13、581±0.020。實驗組N-cadherin的表達水平較陰性對照組、脂質(zhì)體對照組和空白對照組明顯上調(diào)，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.Slug基因的高表達能夠改變絨癌JEG-3細胞學形態(tài)，使其更符合間質(zhì)細胞的形態(tài)特征，從而使其惡性侵襲力增強。
　　2.Slug基因的高表達能夠提高絨癌JEG-3細胞的增殖速率，從而加速其臨床進程。
　　3.Slug基因的高表達能夠使絨癌JEG-3細胞E-ca