P物質(zhì)對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.通過離體培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察P物質(zhì)對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和對IL-1β和IL-10釋放量的檢測。
　　2.通過P物質(zhì)作用于離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，探討活化可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.取出生24 h以內(nèi)的SD乳鼠原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞。將培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為5組：(1)對照組，細(xì)胞孵育全培液；(2)全培液+P物質(zhì)30 nM組；

2、(3)全培液+P物質(zhì)100 nM組；(4)全培液+P物質(zhì)300 nM組；(5)全培液+P物質(zhì)1000 nM組。各組細(xì)胞分別在孵育2h、6h、12h、24h后收集細(xì)胞上清液同時保留細(xì)胞，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.采用免疫細(xì)胞熒光法鑒定GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并觀察P物質(zhì)孵育后星形膠質(zhì)細(xì)胞在各濃度以及各時間點(diǎn)的形態(tài)變化。
　　3.采用ELISA的方法檢測P物質(zhì)孵育后星形膠質(zhì)細(xì)胞在各濃度及各時間點(diǎn)釋放IL-1β和IL-10的

3、情況。
　　4.利用比例高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的胞內(nèi)鈣離子成像技術(shù)觀察P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，其胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定：經(jīng)免疫細(xì)胞熒光法鑒定，培養(yǎng)的細(xì)胞為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。用DAPI復(fù)染后，證實(shí)細(xì)胞的純度達(dá)95％以上。
　　2.P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變：以細(xì)胞孵育全培液作為對照組。30 nM的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h、12 h、24

4、 h分別與之比較，其形態(tài)幾乎無變化。100 nM的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的6 h，部分細(xì)胞的胞體開始變大變圓，突起回縮，呈現(xiàn)出活化的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，且隨著時間的延長，至12 h發(fā)生這種形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，GFAP的免疫染色也增強(qiáng)。300 nM的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的6 h、12 h，呈現(xiàn)活化態(tài)的細(xì)胞數(shù)目均較100 nM組增加，此外GFAP的免疫染色也較100 nM組增強(qiáng)。1000 nM的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后2 h，細(xì)胞形態(tài)

5、開始出現(xiàn)上述變化，但至6 h、12 h時GFAP的免疫染色均低于100 nM、300 nM組。100 nM、300 nM組的星形膠質(zhì)細(xì)胞在孵育至24 h時GFAP的免疫染色均較12 h時減弱。
　　3.IL-1β的檢測結(jié)果：以細(xì)胞孵育全培液組的細(xì)胞上清液作為對照組。30 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h、24 h，細(xì)胞上清液中的IL-1β含量與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而12 h細(xì)胞上清液中的IL-1β含量高于

6、對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100 nM、300 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h、12 h，細(xì)胞上清液中的IL-1β含量較對照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而24 h細(xì)胞上清液中的IL-1β含量與對照組相比，差異不再有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，促進(jìn)其釋放IL-1β，而且具有特定的時間過程。30 nM的P物質(zhì)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β的作用在12 h最明顯，至24 h該作用消失。100 nM、300 nM

7、的P物質(zhì)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β的作用在2 h開始，在6 h作用最強(qiáng)，之后隨著時間的延長，該作用逐漸減弱，至24 h該作用幾乎消失。
　　4.IL-10的檢測結(jié)果：以細(xì)胞孵育全培液組的細(xì)胞上清液作為對照組。30 nM、100 nM、300 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h，細(xì)胞上清液中的IL-10含量與對照組相比均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30 nM、100 nM、300 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的12

8、 h，細(xì)胞上清液中的IL-10含量與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30 nM、100 nM、300 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的24 h，細(xì)胞上清液中的IL-10含量與對照組相比增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞的最初2 h和6 h內(nèi)，抑制其釋放IL-10。然而隨著時間的延長，P物質(zhì)對星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-10的抑制作用逐漸減弱。
　　5.胞內(nèi)鈣離子成像結(jié)果：以細(xì)胞孵育Hanks液作為對照組，60 mM的

9、kcl用于檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能活性。30 nM、100 nM、300 nM、1000 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，其胞內(nèi)鈣離子的濃度與對照組相比均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，其胞內(nèi)鈣離子的濃度高于30 nM、300 nM、1000 nM的P物質(zhì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。300 nM的P物質(zhì)作用后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度高于30 nM、1000 nM的P物質(zhì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而1000 n

10、M的P物質(zhì)作用后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度與30 nM的P物質(zhì)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上說明，P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，其胞內(nèi)鈣離子的濃度升高。其中，以100 nM的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的升高最為顯著。
　　結(jié)論：
　　1.P物質(zhì)能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出活化態(tài)形態(tài)改變。
　　2.P物質(zhì)能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子IL-1β，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎因子IL-10。
　　3.P

11、物質(zhì)對星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用可持續(xù)約12 h，至24 h時該作用減弱甚至消失。
　　4.P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后，其胞內(nèi)鈣離子的濃度升高。100 nM P物質(zhì)的作用最強(qiáng)。
　　5.P物質(zhì)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化參與疼痛的形成，可能與鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活以及促進(jìn)其釋放IL-1β并抑制其釋放IL-10有關(guān)。
　　慢性神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷造成的，其主要表現(xiàn)為異常的痛感受，包括觸誘發(fā)痛（正常非傷害性刺激引

12、起的疼痛）和痛覺過敏（對傷害性刺激過度的痛反應(yīng)）。慢性疼痛可以持續(xù)數(shù)月，給病人帶來極大痛苦，而臨床上也缺乏有效的治療手段。以往痛覺幾十年的研究取得了巨大的成就，對痛覺的中樞區(qū)域、不同中樞的功能作用及相互聯(lián)系、局部的神經(jīng)環(huán)路、痛覺感受器的感受機(jī)制、參與痛覺傳遞的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)等有了深入了解。但既往的研究主要關(guān)注神經(jīng)元、神經(jīng)元構(gòu)成的環(huán)路及神經(jīng)遞質(zhì)的作用。而且基于上述研究結(jié)果設(shè)計(jì)的藥物也是以參與痛覺傳遞的神經(jīng)元為靶標(biāo)，雖有一定療效但對慢性疼痛的

13、治療效果并不理想。近些年神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在痛信號產(chǎn)生、傳遞、痛覺形成中的重要作用被逐漸予以重視，已經(jīng)成為痛覺研究及治療的重要靶點(diǎn)。
　　在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目遠(yuǎn)多于神經(jīng)元，越來越多的資料顯示膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)生理及病理?xiàng)l件下的功能作用非常重要。研究發(fā)現(xiàn)疼痛模型的動物在慢性疼痛發(fā)生時伴隨有脊髓內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，表現(xiàn)為胞體肥大，樹突回縮，表面標(biāo)記蛋白表達(dá)增多等現(xiàn)象。鞘內(nèi)或者全身應(yīng)用神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑后，膠質(zhì)細(xì)胞活化減弱，同時

14、慢性疼痛癥狀也得到緩解。這些結(jié)果均提示，慢性疼痛的形成與脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化相關(guān)。但由于神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜環(huán)路，常規(guī)的疼痛研究模型無法對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行深入、系統(tǒng)的觀察，其研究結(jié)論也難以排除神經(jīng)元的影響。因此神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛信號產(chǎn)生、傳遞過程的作用及機(jī)制，如膠質(zhì)細(xì)胞如何活化，活化后如何發(fā)揮作用等并不明確。
　　研究表明，痛模型的大鼠在損傷部位應(yīng)用局部麻醉藥利多卡因之后脊髓內(nèi)GFAP的表達(dá)減少，而GFAP

15、是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)記蛋白，這些結(jié)果表明，傷害性刺激通過神經(jīng)元繼而引起中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活。提示經(jīng)神經(jīng)元向脊髓傳遞的傷害性信號可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的啟動因素。
　　外周感覺神經(jīng)元向脊髓傳遞感覺信號的物質(zhì)基礎(chǔ)是神經(jīng)遞質(zhì)，P物質(zhì)屬于速激肽家族，是脊髓水平傳遞痛信號特異的神經(jīng)遞質(zhì)。NK1受體是P物質(zhì)的特異性受體，研究發(fā)現(xiàn)NK1受體在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有分布。常規(guī)在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)所獲得的，這種方式無法明確P物質(zhì)對星