丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織TRPM2和EndoG的影響.pdf

1、背景和目的：
　　 慢性腦缺血是大腦長期處于低灌注的一種病理狀態(tài)，它可導致腦細胞氧和葡萄糖供應不足，引起一系列神經功能障礙。隨著世界上老齡人口所占比率不斷上升，慢性腦缺血及其伴隨性疾病逐漸增多，引起的認知減退和退行性神經系統疾病對生活質量和社會經濟造成重大影響。故而，探討慢性腦缺血損傷的發(fā)病機制，提出有效的預防和治療措施迫在眉睫。
　　 瞬時感受器電位M2型(transient receptor potential me

2、lastain2，TRPM2)通道是近年來新發(fā)現的非谷氨酸依賴的陽離子通道，在中樞神經系統的神經元和神經膠質細胞中均有表達，在缺血缺氧損害及各種有害因素的作用下，細胞膜上的TRPM2通道被激活，并介導鈣離子的出入胞活動，導致鈣超載，并誘導細胞凋亡。TRPM2作為新發(fā)現的陽離子通道，在缺血性神經系統疾病中的作用成為當前研究的熱點之一。
　　 核酸內切酶G（endonuclease G，EndoG）是一種鈣離子依賴性內切酶，其誘導凋

3、亡的方式不依賴caspases途徑。在慢性腦缺血損傷中，細胞內的鈣超載以及缺血過程中產生的tBid、Bax能夠誘導EndoG自線粒體中釋放到包漿中，并隨即轉位至胞核中，引起線粒體斷裂，導致細胞凋亡。
　　 丁基苯酞(dl-butylphthalide，NBP)對急性腦缺血具有較好的療效，但在慢性腦缺血中是否通過影響TRPM2和EndoG而發(fā)揮神經保護作用尚未見報道。本文旨在觀察丁基苯酞對慢性腦缺血老齡大鼠腦組織中TRPM2和En

4、doG蛋白表達的影響，深入了解丁基苯酞對慢性腦缺血腦組織的神經保護作用，為慢性腦缺血的有效預防和治療提供理論新的思路。
　　 材料和方法
　　 選取80只質量為450-550g的清潔級Wister大鼠，7天的適應性飼養(yǎng)，經水迷宮測試合格后用于試驗。大鼠隨機分為4組，每組20只，A組：對照組（假手術）；B組：模型組（手術+溶劑）；C組：缺血丁基苯酞低劑量治療組（手術+低劑量+溶劑）；D組：缺血丁基苯酞高劑量治療組（手術+高

5、劑量+溶劑）。采用雙側頸總動脈永久結扎(BCAL)，建立慢性腦缺血動物模型，術后2個月，morris水迷宮測試大鼠學習和記憶功能。A組和B組予以溶劑（消毒花生油）灌胃，C組和D組分別予以丁基苯酞60mg/kg/d、120mg/kg/d灌胃。灌胃1個月后，再次經morris水迷宮測試大鼠學習和記憶功能，然后麻醉大鼠，開胸暴露心臟，以生理鹽水200ml經心臟加壓快速沖洗，驅除血管內血液，斷頭取腦，置于4％多聚甲醛內固定24小時，常規(guī)脫水、透

6、明、浸蠟、包埋。冠狀位切片，片厚4um，HE染色觀察腦組織形態(tài)學變化，免疫組化(SP)法染色檢測TRPM2、EndoG的表達變化。數據以均數±標準差((?)±s)表示，SPSS13.0統計軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析(One-way.ANOVA)，兩組間比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。
　　 結果
　　 1．實驗動物的一般行為觀察
　　 術前大鼠表現活潑，反應敏捷，能自主攝食和飲水，

7、術后早期，B、C、D各組大鼠精神萎靡，食欲不振，少動，易激惹，A組大鼠較術前無明顯變化，術后7天，各組基本情況緩慢好轉。
　　 2．學習和記憶功能觀察
　　 術前各組大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數比較，差異沒有統計學意義(P＞0.05)；各組模型制作(BCAL)后2個月，B組較A組逃避潛伏期明顯延長，跨越平臺次數明顯減少，差異均有統計學意義(P＜0.05);BCAL后3個月，C組和D組逃避潛伏期縮短，跨越平臺次數有所增加，

8、差異均有統計學意義(P＜0.05)。
　　 3．HE染色
　　 各組腦組織的顳葉皮層和海馬區(qū)域均未發(fā)現明顯的梗死性病灶，A組大鼠海馬及顳葉皮層神經元神經元層次豐富，大部分形態(tài)正常，偶見變性壞死細胞；B組海馬及顳葉皮層僅可見少量形態(tài)正常的神經元，神經元大部分變性、消失；C組海馬及顳葉皮層神經元與B組相比消失減少，正常神經元數量增多；D組海馬及顳葉皮層變性和死亡的神經元較B組明顯恢復。
　　 4.TRPM2免疫組化染

9、色
　　 TRPM2蛋白免疫反應產物顯示為棕黃色或棕褐色著色，大部分定位于神經元包膜和胞漿中。A組皮層和海馬僅可見少量TRPM2蛋白表達；B組TRPM2蛋白陽性產物顯著增多；C組：TRPM2蛋白陽性產物較B組有所減少；D組TRPM2蛋白陽性產物較B組明顯減少。在海馬中，單因素方差分析F值為127.115，P＜0.01，差異有統計學意義；在皮層中，F值為310.046，P＜0.01，差異有統計學意義。
　　 5．EndoG

10、免疫組化染色
　　 EndoG蛋白免疫反應產物顯示為棕黃色或棕褐色著色，定位于神經元胞漿和胞核中。A組皮層和海馬僅可見少量EndoG蛋白表達；B組EndpG蛋白陽性產物顯著增多；C組和D組EndoG蛋白陽性產物較B組減少，其中D組下降較為明顯。在海馬中，單因素方差分析F值為80.292，P＜0.01，四組間差異有統計學意義：在皮層中F值為49.959，P＜0.01，四組間差異有統計學意義。
　　 結論
　　 1．