丁基苯酞對(duì)慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)IGF-1和Nogo-A表達(dá)的影響.pdf

1、腦血管病是目前世界上最常見的老年疾病之一,發(fā)病率、致殘率及復(fù)發(fā)率均高,與心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成人類的三大致死病因,其中缺血性腦血管病占全部腦血管病的大部分,是最常見的腦卒中。慢性腦供血不足最早是在1990年由日本醫(yī)學(xué)家提出來(lái)的,是指各種原因?qū)е麓竽X出現(xiàn)慢性的廣泛的供血不足,引發(fā)腦部缺血缺氧而出現(xiàn)一系列腦部功能障礙臨床表現(xiàn)的疾病。目前腦血管病后大腦功能的可塑性研究成為了醫(yī)療界的熱點(diǎn)。影響腦血管病后功能恢復(fù)的因素十分復(fù)雜,大致可分為促進(jìn)因素和

2、抑制因素兩個(gè)方面。
　　腦缺血后能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡,但同時(shí)內(nèi)部的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制也被激活,二者的平衡決定了缺血神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)局。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)被公認(rèn)為對(duì)腦缺血具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用,在大鼠和羊的腦缺血模型上已得到證實(shí)。它是一種小分子多肽(7.5Kda),結(jié)構(gòu)上類似胰島素原,屬于生長(zhǎng)因子家族,對(duì)成熟神經(jīng)元增殖、分化、存活具有重要的作用。而已有研究發(fā)現(xiàn)IGF-1可提高神經(jīng)元的存活率,可促進(jìn)神經(jīng)突觸形成,具有維持神經(jīng)細(xì)胞功

3、能、改善老齡動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力的作用。在利用具有自發(fā)性卒中傾向的高血壓大鼠制作腦缺血再灌注模型中,外源性注射IGF-1可使大鼠海馬神經(jīng)元調(diào)亡細(xì)胞減少,對(duì)損傷后神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在能夠限制神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生功能的蛋白,髓鞘相關(guān)蛋白神經(jīng)突起生長(zhǎng)抑制分子Nogo是其中最主要的蛋白,分為Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C三種主要異構(gòu)體,其中以Nogo-A與神經(jīng)再生的關(guān)系最為密切,是哺乳動(dòng)物中樞

4、神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生障礙的重要原因之一。Nogo-A作用的消除可以導(dǎo)致大腦缺血損傷部位結(jié)構(gòu)的重塑和功能的恢復(fù)。同樣Nogo-A基因的失活可以對(duì)卒中后的老鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的保護(hù)作用。有研究表明慢性腦缺血后認(rèn)知能力的減退,是由于Nogo-A的強(qiáng)烈表達(dá)造成的,它能夠使神經(jīng)元間的纖維聯(lián)系受損,抑制新生顆粒細(xì)胞的軸突生長(zhǎng),抑制慢性腦缺血后神經(jīng)功能和認(rèn)知能力的恢復(fù)。丁基苯酞(dl-butylphthalide,NBP)是我國(guó)自主研發(fā)的擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的化學(xué)

5、藥物,具有安全性單一體結(jié)構(gòu),是治療急性腦缺血的一種新藥,在慢性腦缺血中研究較少。
　　本文利用2VO建立慢性腦缺血模型,通過(guò)Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠行為學(xué)變化,用免疫組化方法觀察大鼠在對(duì)慢性腦缺血適應(yīng)過(guò)程中的Nogo-A和IGF-1表達(dá)變化,并探討丁基苯酞對(duì)其表達(dá)的影響和對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性慢性腦缺血的保護(hù)作用。
　　材料方法：
　　1.動(dòng)物分組及給藥方法健康Wistar大鼠80只,隨機(jī)分為A組:對(duì)照組(假手術(shù)+溶劑);B組

6、:單純?nèi)毖M手術(shù)+溶劑);C組:缺血低劑量治療組(手術(shù)+低劑量NBP+溶劑);D組:缺血高劑量治療組(手術(shù)+高劑量NBP+溶劑);后兩組于造模2月水迷宮結(jié)束后開始治療,分別按60mg/kg、120mg/kg給予丁基苯酞灌胃,丁基苯酞用花生油稀釋至2ml。前兩組每日給予花生油2ml灌胃,各組皆連續(xù)每日灌胃,持續(xù)一個(gè)月。
　　2.模型的制作鈍性分離B、C、D組大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用O號(hào)手術(shù)線分別結(jié)扎其近心端及遠(yuǎn)心端;分離對(duì)照組雙側(cè)頸總動(dòng)

7、脈但不結(jié)扎。術(shù)后各組大鼠均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。
　　3.標(biāo)本的制作術(shù)后3月,所有大鼠經(jīng)心臟灌注后,斷頭取腦,用4％的多聚甲醛固定后做石蠟切片,供HE染色和免疫組化用。
　　4.觀察指標(biāo)
　　4.1各組于2VO后3月行Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)價(jià)。
　　4.2采用HE染色觀察大鼠海馬和顳葉皮層的神經(jīng)元細(xì)胞變化。
　　4.3免疫組化觀察大鼠海馬和顳葉皮層IGF-1和Nogo-A的表達(dá)。
　　

8、5.統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差±s表示,應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),用LSD法進(jìn)行兩兩比較,取a=0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為觀察術(shù)后各組大鼠均出現(xiàn)進(jìn)食進(jìn)水減少,精神差,行為異常。術(shù)后1-2天,除A組精神恢復(fù)外,其余各組行為恢復(fù)不明顯。4-6天B、C、D大鼠逐漸恢復(fù),一周時(shí)基本正常。
　　2.認(rèn)知能力利用Morris

9、水迷宮測(cè)定后發(fā)現(xiàn),2VO后3月B組與A組比較逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng),跨過(guò)平臺(tái)所次數(shù)明顯減少,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):C、D組與B組比較逃避潛伏期時(shí)間明顯減少,跨過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),D組與C組比較避潛伏期時(shí)間減少,跨過(guò)平臺(tái)次數(shù)有所增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.HE染色A組:海馬神經(jīng)元細(xì)胞未見變性、壞死,細(xì)胞形態(tài)正常。B組:海馬大量神經(jīng)元細(xì)胞缺血性變性、壞死,正

10、常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較A組明顯減少。C組:海馬神經(jīng)元變性、壞死較B組減輕,正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較B組明顯增多。D組:海馬神經(jīng)元變性、壞死較C組明顯減輕,正常神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較C組明顯增多。
　　4.IGF-1免疫組化染色各組取顳葉皮層和海馬進(jìn)行觀察,并統(tǒng)計(jì)IGF-1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),IGF-1陽(yáng)性細(xì)胞在皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及紋狀體區(qū)具有廣泛性表達(dá),陽(yáng)性神經(jīng)元胞漿呈棕黃色著色。A組IGF-1蛋白呈少量表達(dá),B組IGF-1的表達(dá)與A組相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P>0.05)。C組和D組IGF-1表達(dá)明顯多于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且D組IGF-1表達(dá)明顯多于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.Nogo-A免疫組化染色各組取顳葉皮層和海馬進(jìn)行觀察,并統(tǒng)計(jì)Nogo-A蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),Nogo-A蛋白主要分布于大鼠腦內(nèi)的小突膠質(zhì)細(xì)胞及部分神經(jīng)元和纖維胞漿及突起內(nèi),呈棕黃色或棕褐色著色。A組Nogo-A呈少量表達(dá),B組Nogo-A表達(dá)均明顯多于A組,差異