擬態(tài)弧菌OmpU基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析.pdf

1、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus，Vm）為人和水產(chǎn)動(dòng)物共患病病原菌，其侵入水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的體內(nèi)后，通過黏附素的識(shí)別作用下，黏附、定植于易感細(xì)胞表面生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生大量的毒力因子可以作用于宿主內(nèi)的組織細(xì)胞，從而引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物腹水病的發(fā)生，導(dǎo)致大批量的死亡，不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的危害，同時(shí)也威脅著人類的健康。因此，對(duì)腹水病防治的研究成為重要問題。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，擬態(tài)弧菌外膜蛋白U（OmpU）的N末端含有黏附素基序，重組OmpU蛋白

2、具有免疫保護(hù)作用，抗OmpU抗體具有明顯的黏附抑制作用，提示OmpU蛋白是擬態(tài)弧菌的黏附素，但由于黏附抑制作用有可能是抗原抗體反應(yīng)造成的空間位阻效應(yīng)，所以O(shè)mpU蛋白的黏附作用仍需確認(rèn)。在此研究背景下，本研究以擬態(tài)弧菌高致病性菌株04-14為親本菌株，以O(shè)mpU基因作為研究對(duì)象，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建OmpU基因缺失株，并在此基礎(chǔ)上比較分析野生株和缺失株在基本生物學(xué)特性、細(xì)胞黏附性和毒力等方面的差異，以期確證擬態(tài)弧菌OmpU蛋白的黏附功能

3、及其所介導(dǎo)的致病作用，從而為篩選用于防治疾病的黏附拮抗劑奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　1、重組自殺性質(zhì)粒pWM91-ΔOmpU的構(gòu)建
　　根據(jù)GenBank中登錄的擬態(tài)弧菌Vm223參考株的OmpU基因上、下游序列，質(zhì)粒pKD3序列以及pWM91的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，以魚源擬態(tài)弧菌04-14基因組為模板，分別擴(kuò)增OmpU基因的上游和下游序列；以質(zhì)粒pKD3為模板，擴(kuò)增Cm抗性基因片段；利用重疊PCR方法獲得上

4、、下游同源臂與Cm抗性基因的融合片段（OmpUR-CmR-OmpUL，2179bp）并克隆至質(zhì)粒pUC57。測(cè)序正確后，用XhoⅠ/NotⅠ雙酶切融合片段和自殺質(zhì)粒pWM91，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coli S17-1中，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過酶切后獲得大小約為8261bp和2179bp兩條DNA條帶，分別與pWM91和融合片段的大小一致。DNA測(cè)序結(jié)果亦顯示3個(gè)DNA片段序列和連接順序完全正確，說明重組自殺性質(zhì)粒pWM91-ΔOmpU構(gòu)

5、建成功。
　　2、接合轉(zhuǎn)移與OmpU基因缺失株的篩選鑒定
　　以攜帶重組自殺性質(zhì)粒pWM91-ΔOmpU的E.coli S17-1為供體菌，擬態(tài)弧菌04-14菌株為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)。以氨芐抗性標(biāo)記和蔗糖致死性基因進(jìn)行雙重篩選，得到疑似 OmpU基因缺失株。分別用引物對(duì) OmpU-1/OmpU-2、Cm-1/Cm-2、OmpUL-1/Cm-2、Cm-1/OmpUR-2對(duì)OmpU基因缺失株進(jìn)行組合PCR鑒定，結(jié)果分別擴(kuò)增出

6、大小為1072、1013、1674和1525 bp的目的基因片段，測(cè)序鑒定結(jié)果亦證明OmpU基因缺失株構(gòu)建成功。
　　3、OmpU基因缺失株的基本生物學(xué)特性測(cè)定
　　在構(gòu)建OmpU基因缺失株的基礎(chǔ)上，對(duì)缺失株的遺傳穩(wěn)定性、形態(tài)染色特性、生長(zhǎng)特性、培養(yǎng)特性和生化特性等基本生物學(xué)特性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)傳代25代后突變株均能穩(wěn)定遺傳；缺失株較野生株生長(zhǎng)速率緩慢，喪失了分解麥芽糖的能力；但野生株與缺失株的形態(tài)染色特性、培養(yǎng)特性

7、和其他生化特性沒有明顯差異。
　　4、OmpU基因缺失株的細(xì)胞黏附性測(cè)定
　　以鯉魚乳頭狀上皮瘤細(xì)胞（EPC）為體外細(xì)胞黏附模型，對(duì)比研究OmpU基因缺失株和野生株的細(xì)胞黏附能力。將缺失株與野生株分別和EPC細(xì)胞于室溫下共孵育60min，洗去未黏附的細(xì)菌后，同時(shí)采用顯微鏡檢查法和細(xì)菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)EPC細(xì)胞的黏附情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生株與缺失株對(duì)每個(gè)細(xì)胞的平均黏附菌數(shù)分別為32.3±4.5和10.8±0.5，PBS空白對(duì)照組的

8、細(xì)胞形態(tài)完好，無細(xì)菌黏附。以野生株對(duì)EPC細(xì)胞的粘附能力作為參照，OmpU基因缺失株黏附細(xì)胞的能力顯著下降了66.6％（P＜0.01），說明OmpU蛋白是擬態(tài)弧菌的黏附素。
　　5、OmpU基因缺失株的毒力測(cè)定
　　為了研究OmpU蛋白對(duì)擬態(tài)弧菌毒力的影響，測(cè)定OmpU基因缺失株和野生株的對(duì)實(shí)驗(yàn)草魚的半數(shù)致死量LD50。即將野生株分別以1.92×106、7.68×105、3.06×105、1.22×105和4.88×104

9、CFU/fish腹腔注射體重50g左右的實(shí)驗(yàn)草魚，缺失株分別以11.25×106、7.5×106、6×106、4×106和2.67×106 CFU/fish腹腔注射實(shí)驗(yàn)草魚，注射后各組魚轉(zhuǎn)移至不同的魚缸飼養(yǎng)，并將水溫控制在28±1℃，觀察記錄14天內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚的發(fā)病和死亡情況，并根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算突變株和野生株的LD50。結(jié)果顯示，野生株和缺失株的LD50分別為1.07×106 CFU/mL和4.43×106 CFU/mL，與