致雛肉雞“黑腺胃病”APEC的鑒定與ompF,metF基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC）能引起禽類局部或全身性感染。全身感染即大腸桿菌型敗血癥，主要特征是大腸桿菌存在于血液中，其發(fā)展階段包括急性敗血癥、亞急性多發(fā)性漿膜炎和慢性肉芽腫性炎癥。局部感染性禽大腸桿菌病包括大腸桿菌型臍炎/卵黃囊感染、大腸桿菌型蜂窩織炎、腫頭綜合征、生殖道感染、大腸桿菌型輸卵管炎/腹膜炎和大腸桿菌型睪丸炎/附睪炎等。大量國內(nèi)外研究表明，因地理區(qū)域不同，大

2、腸桿菌血清型呈現(xiàn)多樣性，但最常見的為O1、O2、O35、O78。某些感染的暴發(fā)病例是由不常見的血清型造成的，如O111血清型分離株可造成產(chǎn)蛋母雞發(fā)生多臟器的漿膜炎、敗血癥。還有一些致病性大腸桿菌菌株血清型不明確或者不能分型。
　　近年來，在江蘇、山東、安徽、河南等省規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)頻繁出現(xiàn)一種雛肉雞“黑腺胃病”（暫命名），發(fā)病區(qū)域分散，發(fā)病日齡早，主要集中在3～5日齡，有時(shí)在7～8日齡出現(xiàn)，死淘率3％～12％。商品肉雞出雛時(shí)外觀健

3、康，死亡前幾無可見臨診癥狀。剖檢病理變化以腺胃呈灰黑色為主（發(fā)黑程度隨病情輕重而呈淺灰色或灰色，嚴(yán)重時(shí)呈黑色）、病程稍長者，可見心包炎、肝周炎、氣囊炎。迄今，具有腺胃變黑變化的肉雛雞疾病尚未見報(bào)道。
　　本研究旨在對(duì)臨床以腺胃發(fā)黑為特征的病死肉雛雞進(jìn)行病原的分離鑒定，人工感染復(fù)制肉雛雞“黑腺胃病”，探明所分離的致病性大腸桿菌血清型、致病性、種系發(fā)生群、毒力基因型;選擇從同一病死個(gè)體腺胃分離的APEC4d/9-1 O142菌株和AP

4、EC4d/9-1 O142心血分離株進(jìn)行毒力基因和模型動(dòng)物的致病性比較，通過DNA芯片技術(shù)對(duì)這兩個(gè)分離株在SPF雞體內(nèi)和體外的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選APEC腺胃分離株潛在的毒力基因;選擇表達(dá)差異基因進(jìn)行缺失株的構(gòu)建，評(píng)價(jià)基因缺失株與致病性的關(guān)系，最終為弄清APEC引發(fā)雛肉雞“黑腺胃病”的發(fā)病機(jī)制和防制措施提供依據(jù)。
　　1.致雛肉雞“黑腺胃病”致病性大腸桿菌的分離鑒定
　　本試驗(yàn)對(duì)江蘇省某大型肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)雛肉雞“黑腺胃病”病

5、例進(jìn)行了病原的分離鑒定，同時(shí)對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)不同日齡死亡雞胚、飼料、出雛器和雞舍空氣進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定。共分離獲得大腸桿菌96株，除5株未能定型外，共鑒定出88個(gè)分離株的O血清型，優(yōu)勢(shì)血清型分別為:O142、O45、O86和O78，其中O142共有46個(gè)分離株，占本次定型菌株的52.27％(46/88)，且O142血清型為首次在致死雞中分離到。用分離到的優(yōu)勢(shì)血清型O142大腸桿菌分離株進(jìn)行了人工感染，結(jié)果該病原人工感染易感肉雞能復(fù)制出與臨

6、診幾乎一致的疾病。選擇來自病死雞中同一個(gè)體的腺胃和心血分離株各10個(gè)，以107菌落形成單位(colony forming units，CFU)分別氣囊感染1日齡健康易感肉雞和SPF雞，結(jié)果顯示所有腺胃分離株恒能引起2種雞6/6(100％)死亡，而心血分離株則可引起3/6～4/6(50～67％)的雞死亡。腺胃分離株接種后病死肉雞83％～100％（5～6羽）腺胃變黑，而心血分離株接種的病死肉雞以及所有病死的SPF雞的腺胃無此變化。毒力基因檢

7、查結(jié)果顯示，絕大部分菌株都攜帶iutA，fimH, frzorf4，ompT和feoB基因(≥88)，50％以上分離株都攜帶cvaC，iroN,iucC,iucD,sitA,traT, irp-2,tsh,astA和neuC，而afa,papA,papG allele I,sfa,sfaS, fela,cdtB,vat和ace26基因檢出率均低于10％。分離株種系發(fā)生分型結(jié)果顯示，以B2為主，占受試分離株的58.33％，D型、A型和B1

8、型分別占11.46％、19.79％和10.42％。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株呈多重耐藥性，尤其大部分O142血清型分離株均對(duì)頭孢噻呋鈉耐藥。重金屬檢測(cè)結(jié)果顯示所有病死雞的內(nèi)臟組織中汞均超標(biāo)，而發(fā)病雞舍污染飼料和試驗(yàn)對(duì)照雞內(nèi)臟均不超標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明分離的分離株經(jīng)氣囊接種肉雞和SPF雞均為高致病株;死亡雞胚和病肉雞舍料槽中污染的飼料樣品中，可分離出與雛雞病例一致的O142致病性大腸桿菌，暗示飼料可能成為同群易感肉雞致病性大腸桿菌的來源;汞不是

9、造成雛肉雞死亡和黑腺胃的原因，但可能加重黑腺胃變黑的程度。
　　2.同一個(gè)體APEC腺胃分離株和心血分離株毒力基因及致病性比較
　　為探明前期研究中從同一病死個(gè)體腺胃分離的APEC4d/9-1 O142菌株和APEC4d/9-1O142心血分離株是否為相同菌株及評(píng)價(jià)兩者對(duì)動(dòng)物的致病性。首先對(duì)兩株菌進(jìn)行了半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定及體內(nèi)定居與持續(xù)試驗(yàn)。半數(shù)致死量結(jié)果顯示APEC4d/9-1 O142腺胃分離株比APEC4d/9

10、-1O142心血分離株的毒力高100倍;體內(nèi)定居與持續(xù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，腺胃分離株在感染雞肺內(nèi)的細(xì)菌載量比心血分離株高10倍(P＜0.01)，在心血、肝臟、腎臟和腺胃則高100倍(P＜0.001)，腺胃分離株可使人工感染病死的AA肉雞的腺胃變黑，但病死SPF雞腺胃不變黑。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明:來自同一個(gè)體的4d/9-1 O142腺胃分離株的毒力確實(shí)顯著高于4d/9-1 O142心血分離株。為進(jìn)一步闡明這兩個(gè)菌株之間的差異，本研究對(duì)二者的毒力基因

11、、種系發(fā)生群、多位點(diǎn)序列分型和脈沖場(chǎng)凝膠電泳進(jìn)行了檢測(cè)。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示:在受檢的32個(gè)毒力基因中，鐵攝取基因、保護(hù)素基因的出現(xiàn)率相對(duì)較高，而粘附素、毒素基因的出現(xiàn)率相對(duì)較低，腺胃分離株僅比心血分離株多了1個(gè)鐵攝取相關(guān)的毒力基因feoB。兩個(gè)分離株均屬B2分子發(fā)生群;但多位點(diǎn)序列分型顯示腺胃分離株為ST131，而心血分離株為ST2704，表明盡管分離自同一個(gè)體，但2個(gè)分離株基因組水平確實(shí)存在差異;脈沖場(chǎng)電泳顯示兩者的相似系數(shù)為97.

12、3％，說明二者存在著遺傳差異。
　　3.APEC O142腺胃分離株和心血分離株在雞體內(nèi)外的表達(dá)差異基因的篩選
　　O142是一個(gè)十分罕見的禽源性大腸桿菌的血清型，前期研究結(jié)果顯示來自同一個(gè)體的O142腺胃分離株和心血分離株都屬強(qiáng)毒株，但前者毒力比后者高100倍。己知毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，除了前者少一個(gè)feoB基因外所有毒力基因完全相同，已有研究表明feoB基因與致病性大腸桿菌致病性無關(guān)。為此，本研究選擇APEC4d/9-1

13、 O142腺胃分離株和心血分離株為研究對(duì)象，應(yīng)用商品化大腸桿菌基因芯片對(duì)選擇的致病性大腸桿菌分離株進(jìn)行以SPF雞作動(dòng)物模型的體內(nèi)外表達(dá)基因譜檢測(cè)，篩選部分潛在的新毒力基因。該芯片系統(tǒng)共包含10113條探針，因此，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模潛在毒力基因的篩選。試驗(yàn)結(jié)果顯示，APEC4d/9-1腺胃分離株和心血分離株在體內(nèi)比體外差異表達(dá)基因數(shù)量分別達(dá)到1502個(gè)和2260個(gè)。APEC4d/9-1腺胃分離株體內(nèi)對(duì)體外表達(dá)差異分析結(jié)果顯示，在1502個(gè)差異

14、表達(dá)基因中表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)?27個(gè)，其中包含195個(gè)特異性探針對(duì)應(yīng)的己知基因，68個(gè)假定基因;表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)?75個(gè)，其中包含217個(gè)特異性探針對(duì)應(yīng)的己知基因，83個(gè)假定基因;5倍以上差異基因共97個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為41個(gè)和56個(gè)。表達(dá)差異最顯著的基因是narG,narU,narJ,narH,hark,narI,ompF,metF和nanA基因。4d/9-1心血分離株體內(nèi)對(duì)體外表達(dá)差異分析結(jié)果顯示在2260個(gè)差異表達(dá)

15、基因中表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)?51個(gè)，其中包含146個(gè)特異性探針對(duì)應(yīng)的己知基因，78個(gè)假定基因;表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)?609個(gè)，其中包含281個(gè)特異性探針對(duì)應(yīng)已知基因，75個(gè)假定基因;5倍以上表達(dá)差異基因共177個(gè)，其中包含上調(diào)表達(dá)差異基因?yàn)?4個(gè)，下調(diào)表達(dá)差異基因?yàn)?33個(gè)。上調(diào)表達(dá)差異最顯著的基因是narU,narG,narH,narJ,nark,ompF,metF,pta,fdnG,gpmM和nanA基因等。腺胃分離株與心血分離株體內(nèi)分別與

16、各自的體外表達(dá)譜相比上調(diào)或下調(diào)基因數(shù)量較多，但與心血分離株的體內(nèi)表達(dá)譜相比，腺胃分離株在體內(nèi)差異表達(dá)基因數(shù)量較少，共159個(gè)差異表達(dá)基因，原因可能是兩者是從同一個(gè)體內(nèi)分離出、同一血清型O142，種系發(fā)生群同屬B2群，雖然ST分型及動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示兩者為兩株菌，但很可能兩者的同源率較高。在159個(gè)差異表達(dá)基因中包含了上調(diào)表達(dá)基因126個(gè)，其中差異表達(dá)基因最顯著為yehX,nrfG,lamb,ompF,gadB,ynjE,ygaM,yeiC

17、,gltD和metF;4d/9-1腺胃分離株與4d/9-1心血分離株相比共有33個(gè)下調(diào)表達(dá)差異基因，差異表達(dá)基因最顯著為/euB,nhaR,sdaB,yghJ,ytfQ,ycdT,c2481,kpsM,C3689和ECsJ505。對(duì)4d/9-1腺胃分離株與4d/9-1心血分離株分離株在雞體內(nèi)差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene ontology(GO)分析，結(jié)果顯示，GO注釋結(jié)果中cell part,binding,catalytic,transp

18、orter, cellular process，metabolic process功能所占的比例最大。暗示這些基因在致病性大腸桿菌感染雞體內(nèi)生長繁殖及發(fā)揮致病作用時(shí)有主要作用。用qRT-PCR方法，分別對(duì)感染雞體內(nèi)表達(dá)上調(diào)的yjhQ,C3292,nuoM,narH,metF,ompF基因和表達(dá)下調(diào)的fimA,C0719,yjdB,yedV基因表達(dá)做了解析驗(yàn)證。結(jié)果顯示，除了表達(dá)上調(diào)的nuoM和表達(dá)下調(diào)的yjdB基因與基因芯片結(jié)果存在一定

19、差異外，其他驗(yàn)證基因均與芯片結(jié)果一致。
　　4.禽致病性大腸桿菌E491P株ompF,metF基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　對(duì)在基因芯片試驗(yàn)中篩選出的APEC4d/9-1腺胃分離株(4d/9-1 proventricular isolate，E491P)體內(nèi)外呈顯著差異表達(dá)基因ompF和metF基因，利用λRed重組系統(tǒng)分別構(gòu)建ompF和metF基因缺失株E491PΔompF和E491PΔmetF，研究兩個(gè)缺失株的

20、生物學(xué)特性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失株E491PΔompF和E491PΔmetF的生長速度、抗血清補(bǔ)體殺菌能力較野生株無顯著差異，但缺失株ΔompF生長速度略低于野生株。1日齡雛雞LD50致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，野生株E491P、缺失株E491PΔompF和E491PΔmetF LD50分別為103.8、105.0和104.0，結(jié)果表明僅缺失株E491PΔompF致病性被致弱;35日齡SPF雞體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺失株ΔompF在雞體內(nèi)定植