豬鏈球菌2型fbps基因突變株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)是導(dǎo)致豬鏈球菌病主要的病原菌。該菌可分為33個(gè)血清型，其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type2，SS2)致病性強(qiáng)、流行最廣泛并且在臨床上，該型是分離率最高的血清型之一。SS2可引起豬的腦膜炎、化膿性肺炎和心肌炎等疾病。SS2可通過(guò)直接感染特定從業(yè)相關(guān)人群，嚴(yán)重的病例發(fā)生中毒性休克綜合癥，導(dǎo)致多臟器衰竭及死亡，是一種重要的人畜共患病。近幾年豬鏈球菌病的

2、幾次爆發(fā)流行，因此SS2成為了國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注和研究的熱點(diǎn)，尤其是關(guān)于其致病和免疫防治。
　　 SS2對(duì)宿主的粘附過(guò)程可能是其致病過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵的步驟。SS2和宿主細(xì)胞的粘附并非一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程，在細(xì)菌和細(xì)胞表面都有多種相關(guān)因子參與了此過(guò)程，因此研究在此過(guò)程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子可能會(huì)對(duì)SS2致病機(jī)理闡釋發(fā)揮重要作用。
　　 豬鏈球菌2型基因組中的fbps基因編碼了一種具有纖連蛋白結(jié)合位點(diǎn)的表面膜蛋白(fibronectin

3、binding proteins，F(xiàn)BPS)，和它具有同源性的同樣具有Fn結(jié)合活性的蛋白在其他鏈球菌的感染中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，因此推斷，F(xiàn)BPS可能是豬鏈球菌感染的吸附過(guò)程中的一個(gè)重要的參與蛋白。
　　 在此背景之下，我們以SS2高致病性菌株SC19作為親本菌株，以纖連蛋白結(jié)合蛋白編碼基因作為研究對(duì)象，構(gòu)建了fbps基因的缺失突變株，并在此基礎(chǔ)上分析fbps基因的缺失對(duì)SS2基本生物學(xué)性狀以及對(duì)致病力的影響，主要研究?jī)?nèi)容包括：<

4、br>　　 1溫敏型自殺性重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 以2005年四川分離的SS2高致病性菌株SC19為親本菌株，分別擴(kuò)增fbps基因的780bp上游序列和81bp的下游序列，并利用融合PCR的方法獲得上下游同源臂全長(zhǎng)片段并連接到pMDx-18T載體，構(gòu)建克隆載體pMDx-18T-f，分別用EcoR1和BamH1同時(shí)酶切pMDx-18T-f和pSET4s載體后連接，構(gòu)建自殺性重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSET4s-fbps。
　　 2纖連

5、蛋白結(jié)合蛋白fbps基因突變株的構(gòu)建
　　 將重組質(zhì)粒pSET4s-fbps電轉(zhuǎn)化親本菌株SC19感受態(tài)細(xì)胞，以壯觀霉素抗性標(biāo)記和溫度敏感雙重篩選，得到fbps基因缺失突變菌株。并進(jìn)一步通過(guò)PCR等方式對(duì)篩選出的突變菌株進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 3纖連蛋白結(jié)合蛋白fbps基因突變株生物學(xué)性狀的研究
　　 在構(gòu)建的fbps基因突變株的基礎(chǔ)上，研究缺失菌株的遺傳穩(wěn)定性，體外生長(zhǎng)和增殖的能力等生物學(xué)性狀。結(jié)果表明，連續(xù)傳代十代

6、突變株均能穩(wěn)定遺傳。野生株和突變株的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的差異，fbps基因的缺失不會(huì)影響SS2的生長(zhǎng)和繁殖的速度。
　　 4 fbps對(duì)宿主的吸附侵入以及毒性作用
　　 以Hep-2細(xì)胞為模型，對(duì)比研究fbps缺失菌株和SC19野生型菌株粘附能力和侵入能力，以培養(yǎng)液中LDH的滲出為參照，測(cè)定培養(yǎng)液中LDH含量，比較突變株和野生菌株對(duì)細(xì)胞毒性作用。結(jié)果表明，fbps基因缺失突變株對(duì)Hep-2細(xì)胞的粘附能力和親本株SC19相比下降

7、了78%；對(duì)細(xì)胞侵入能力下降23%；測(cè)定LDH的濃度發(fā)現(xiàn)fbps基因突變株比野生型的毒性降低了32%。
　　 5突變株致病性研究
　　 將野生型菌株SC19和fbps基因缺失突變株分別以107cfu/ml，108cfu/ml和109cfu/ml的劑量腹腔注射昆明鼠(1ml)。結(jié)果顯示，注射突變株的死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于注射野生型SC19菌株的試驗(yàn)組。不同時(shí)間點(diǎn)剖殺小鼠不同器官的細(xì)菌動(dòng)態(tài)分布表明，缺失了fbps基因?qū)е录?xì)菌的組織定