高級蛋白氧化產(chǎn)物在血管鈣化中的作用及其機制探討.pdf

1、第一部分：尿毒癥患者高級蛋白氧化產(chǎn)物與血管鈣化的關(guān)系 背景：血管鈣化是慢性腎臟病(CKD)患者心血管事件發(fā)生率和死亡率增加的重要危險因素。氧化應(yīng)激在尿毒癥患者中十分常見，能夠預(yù)計總體和心血管的死亡率。高級蛋白氧化產(chǎn)物(AOPP)是近年來發(fā)現(xiàn)的氧化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷的重要標(biāo)志物。本研究探討CKDV期患者血中水平及其與動脈鈣化的關(guān)系。 方法： 入選50例CKDV期患者，在行動靜脈內(nèi)瘺術(shù)中取部分橈動脈；同期lO例年齡相匹

2、配的胸外科胸腺瘤患者，在術(shù)中選取同級別的胸廓內(nèi)動脈作對照。茜素紅染色測定鈣鹽沉積。免疫組織化學(xué)方法測定骨特異性蛋白——骨橋蛋白(OPN)的表達。H．E．染色測定內(nèi)膜中層厚度(IMT)、管壁/管腔比值。測定血清AOPP、鈣、磷、iPTH水平。 結(jié)果： CKDV期患者血清AOPP水平(90.22±55.88)umol/L明顯高于健康對照者(35.79±4.31)umol/L(P<0.01)。50例橈動脈標(biāo)本中發(fā)生血管鈣化的有

3、24例，發(fā)生率為48％，均發(fā)生在血管中膜，對照組均無鈣化發(fā)生。50例橈動脈標(biāo)本中44例中膜有OPN的陽性沉積(88％)，其中24例鈣化的橈動脈中膜均有OPN表達，26例無明顯鈣化的標(biāo)本中也有20例(76.9％)中膜有OPN的表達。對照組無OPN陽性沉積。24例有動脈鈣化者血清AOPP水平(122.52±66.9umol/L)明顯高于26例無動脈鈣化者(61.29±31.23umol/L)(P<0.01)。Pearson相關(guān)分析顯示血清A

4、OPP水平與血管鈣化程度(r=0.791，P<0.001)、橈動脈IMT(r=0.691，P<0.001)及橈動脈管壁/管腔比值(r=0.354，P<0.05)呈正相關(guān)。血管鈣化程度與AOPP(r=0.791，P<0.001)、血清磷(r=0.602，P<0.01)、血iPTH水平(r=0.549，P<0.05)呈正相關(guān)。 結(jié)論： CKDV期患者普遍存在高AOPP血癥和血管鈣化，血漿AOPP水平與血管鈣化密切相關(guān)。

5、 第二部分、AOPP促進人主動脈平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)分化和鈣化 背景：本文第一部分研究表明尿毒癥患者血AOPP與動脈鈣化密切相關(guān)。但血AOPP水平升高僅僅是氧化應(yīng)激的伴隨現(xiàn)象，還是參與了尿毒癥狀態(tài)下動脈鈣化的發(fā)生發(fā)展呢?近年來已明確血管鈣化是一種類似于骨和軟骨形成的主動調(diào)節(jié)過程，伴隨著血管平滑肌細胞(VSMCs)向成骨樣細胞的轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)“骨樣”蛋白，如骨橋蛋白、堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原等。有研究表明氧化應(yīng)激(如MM-LDL、過氧

6、化氫或黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶等)能夠促進血管細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)分化。因此本試驗是將AOPP直接作用于體外培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細胞(HASMC)，觀察其是否有直接導(dǎo)致平滑肌細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)分化，進而促進血管鈣化的作用。 方法： 將人血清白蛋白(HSA)用濃次氯酸處理，制備AOPP-HSA，并測定其濃度。將AOPP-HSA作用于培養(yǎng)的人主動脈平滑肌細胞(HASMC)，同時設(shè)立正常對照組和單純HSA組(其蛋白濃度與AOPP-HSA

7、中的蛋白濃度一致)。Real-time PCR測定干預(yù)各組72h后細胞的核結(jié)合因子α(cbfα)和骨橋蛋白(OPN)水平。Western blot方法測定各組干預(yù)14天后OPN和平滑肌細胞肌動蛋白α(SM-α-actin)的蛋白表達。各組干預(yù)14天后用濃鹽酸脫鈣，測定上清液的鈣濃度，用細胞蛋白含量標(biāo)化鈣含量。 結(jié)果： 干預(yù)72h后，Real-time PCR結(jié)果提示與對照組相比，AOPP能明顯增加HASMC的cbf-α(

8、16.03±0.45 vs．1.06±0.43，P<0.001=和OPN(4.62±0.34 vs．1.06±0．43，P<0.01=表達，而單純HSA組cbfα-1(1.05±0.06 vs．1.06±0.43)和OPN(0.96±0.08 vs．1.06±0.43)的表達與對照組無明顯差別。干預(yù)14天后，Western blot結(jié)果提示AOPP能明顯誘導(dǎo)HASMC的OPN的表達，使SM-α-actin的表達明顯減少，而單純HSA無此

9、作用。14天后AOPP-HSA組HSAMC的鈣沉積明顯高于對照組(42±2.65 vs．4.23±0.21，P<0.001)，單純HSA組與對照組相比其HASMC的鈣沉積則無明顯變化(4.3±0.35 vs．4.23±0.21，P>0.05)。 結(jié)論： AOPP直接作用能使HASMC明顯降低了平滑肌細胞標(biāo)志性蛋白SM-α-actin的表達，明顯增加HASMC成骨細胞標(biāo)志性蛋白OPN的表達，明顯增加HASMC的cbfα的表

10、達，使HASMC向成骨細胞分化，促進HASMC鈣化。 第三部分、AOPP可能通過氧化應(yīng)激和激活ERK通路促進平滑肌細胞向成骨細胞分化和促進鈣化 背景：本部分進一步探討AOPP介導(dǎo)平滑肌細胞向成骨細胞分化和促進鈣化的可能機制。近來的研究提示AOPP不僅是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，它本身也可能誘導(dǎo)或加重氧化應(yīng)激。因此我們探討AOPP是否通過氧化應(yīng)激而促進HASMC的轉(zhuǎn)分化。另外，分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated

11、 protein kinase，MAPK)家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，特別是其中的ERKl，2途徑，主要介導(dǎo)細胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。且有研究表明MAPK的激活還能促進人間充質(zhì)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)分化。本部分還研究AOPP是否通過激活MAPK通路促進平滑肌細胞向成骨細胞分化。 方法： AOPP-HSA分別干預(yù)HASMC 2h，4h，6h，8h，12h，16h，24h，48h，72h，以氧化敏感的熒光材料2'-7’-二氯熒光素雙醋酸

12、鹽(DCFH-DA)染色，用流式細胞儀測定細胞內(nèi)的氧化水平。HASMC用維生素E預(yù)孵育后再予AOPP作用6h，測定細胞內(nèi)的氧化水平，AOPP干預(yù)14天后用Western blot測定骨橋蛋白(OPN)的表達，并測定細胞的鈣含量。AOPP-HSA分別干預(yù)HASMC 10min，20min，30min，40min，50min，60min，Western blot方法測定p44/42 MAPK，phospho-p44/42MAPK，SAPK/

13、JNK，phospho-SAPK/JNK，p38MAPK，phospho-p38MAPK的蛋白表達。HASMC用MEKl抑制劑PD98059預(yù)孵育后再予AOPP作用14d，Westernblot測定骨橋蛋白(OPN)的表達，并測定細胞的鈣含量。 結(jié)果： AOPP-HSA孵育HASMC2h后，細胞內(nèi)平均熒光強度開始升高，約在6h達到高峰。單純HSA、AOPP-HSA和維生素E預(yù)孵育+AOPP組分別干預(yù)HASMC6h后，HS

14、A對細胞內(nèi)氧化水平無明顯影響，AOPP．HSA明顯增加細胞內(nèi)的氧化水平，維生素E預(yù)孵育后再予AOPP-HSA干預(yù)，細胞內(nèi)氧化水平明顯降低。維生素E預(yù)孵育能使AOPP-HSA誘導(dǎo)的HASMC表達OPN明顯減少(P<0.01)，鈣沉積明顯減少(20±1.00 vs.42±2.65 ug/mg蛋白，P<0.01)。AOPP能夠明顯的激活phospho-ERK。PD98059預(yù)孵育能使AOPP-HSA誘導(dǎo)的HASMC的OPN表達明顯降低(P<0