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文檔簡介
1、第一部分抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在VDN誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型中的作用
目的:氧化應(yīng)激是多種疾病合并的血管鈣化發(fā)生的共同病理因素,但是抗氧化應(yīng)激機(jī)制對血管鈣化的研究尚待深入。本研究擬初步探討機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其調(diào)控的下游抗氧化應(yīng)激分子在維生素D3(Vitamin D3)和尼古?。∟icotine)誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型(VDN)中的變化,通過在體研究證實(shí)其在血管鈣化發(fā)生中的作用。
方法:選取20
2、只兩月齡的Wistar雄性大鼠,隨機(jī)分為對照組和VDN鈣化組,鈣化組大鼠早上9點(diǎn)鐘分別給予尼古?。?5mg/kg)灌胃和維生素D3(30萬單位/kg)肌肉注射,晚上6點(diǎn)再給予尼古丁25mg/kg灌胃一次,對照組給予生理鹽水注射。兩個(gè)月后取大鼠血管組織:硝酸銀染色測定血管鈣化的發(fā)生程度;試劑盒測定組織鈣含量和ALP活性;Westernblot檢測成骨標(biāo)記蛋白Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá),同時(shí)檢測Nrf2及其下游抗氧化酶NQO
3、1的表達(dá)。
結(jié)果:與對照組相比,VDN鈣化組大鼠血管中層出現(xiàn)明顯鈣化,血管組織鈣含量和ALP活性均顯著增加(P<0.05),成骨標(biāo)記蛋白Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)顯著增加;同時(shí),與對照組相比,VDN鈣化組大鼠血管組織 Nrf2及其誘導(dǎo)的抗氧化酶NQO1的表達(dá)也均增加。
結(jié)論:在VDN誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化中,Nrf2及其下游抗氧化酶NQO1被激活,參與了血管鈣化的發(fā)生。
第二部分抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因
4、子Nrf2對高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其分子機(jī)制研究
目的:氧化應(yīng)激、凋亡和成骨樣表型轉(zhuǎn)變是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)參與和調(diào)控血管鈣化的主要機(jī)制,作為機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子,Nrf2在氧化應(yīng)激防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用,具有顯著的抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用,同時(shí)最新的研究也發(fā)現(xiàn),Nrf2是調(diào)控骨代謝和穩(wěn)態(tài)的新型作用因子。本實(shí)驗(yàn)旨在深入探討Nrf2對高磷誘
5、導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用及其分子機(jī)制。
方法:酶解法分離Wistar大鼠的原代血管平滑肌細(xì)胞,分為對照組,鈣化組,Nrf2沉默組和Nrf2激活組。對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),鈣化組的細(xì)胞培養(yǎng)基中給予10mMβ磷酸甘油(βglycerophosphate,βGP)培養(yǎng),Nrf2激活組細(xì)胞同時(shí)選用特異性的Nrf2激活劑DMF和tBHQ干預(yù),Nrf2沉默組細(xì)胞應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使Nrf2表達(dá)沉默。應(yīng)用茜素紅染色檢測各組細(xì)胞鈣化程度;
6、應(yīng)用試劑盒檢測各組細(xì)胞ALP活性和鈣含量;應(yīng)用Westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞Nrf2及其下游NQO1和HO1的表達(dá),以及各組細(xì)胞成骨標(biāo)記BMP2、Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot分別檢測細(xì)胞凋亡比例及cleaved caspase3的表達(dá);應(yīng)用流式細(xì)胞儀及試劑盒分別檢測細(xì)胞ROS活性和MDA含量。
結(jié)果:①與對照組相比,鈣化組細(xì)胞培養(yǎng)10天后茜素紅染色出現(xiàn)
7、明顯的鈣化,細(xì)胞內(nèi)鈣含量和ALP活性均顯著增加,成骨標(biāo)記蛋白BMP2、Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)均顯著增高,細(xì)胞ROS活性及MDA含量顯著上升,cleaved caspase3表達(dá)及細(xì)胞凋亡率也顯著增加。②與對照組相比,Nrf2沉默組Nrf2的mRNA水平降低約70%,Nrf2下游抗氧化酶NQO1和HO1表達(dá)也顯著下降,同時(shí)成骨標(biāo)記蛋白BMP2、Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)均顯著增高,細(xì)胞鈣含量顯著上升。③
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