抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在血管鈣化發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在VDN誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型中的作用
　　目的：氧化應(yīng)激是多種疾病合并的血管鈣化發(fā)生的共同病理因素，但是抗氧化應(yīng)激機(jī)制對血管鈣化的研究尚待深入。本研究擬初步探討機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其調(diào)控的下游抗氧化應(yīng)激分子在維生素D3（Vitamin D3）和尼古?。∟icotine）誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型（VDN）中的變化，通過在體研究證實(shí)其在血管鈣化發(fā)生中的作用。
　　方法：選取20

2、只兩月齡的Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為對照組和VDN鈣化組，鈣化組大鼠早上9點(diǎn)鐘分別給予尼古?。?5mg/kg）灌胃和維生素D3（30萬單位/kg）肌肉注射，晚上6點(diǎn)再給予尼古丁25mg/kg灌胃一次，對照組給予生理鹽水注射。兩個(gè)月后取大鼠血管組織：硝酸銀染色測定血管鈣化的發(fā)生程度；試劑盒測定組織鈣含量和ALP活性；Westernblot檢測成骨標(biāo)記蛋白Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)，同時(shí)檢測Nrf2及其下游抗氧化酶NQO

3、1的表達(dá)。
　　結(jié)果：與對照組相比，VDN鈣化組大鼠血管中層出現(xiàn)明顯鈣化，血管組織鈣含量和ALP活性均顯著增加（P<0.05），成骨標(biāo)記蛋白Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)顯著增加；同時(shí)，與對照組相比，VDN鈣化組大鼠血管組織 Nrf2及其誘導(dǎo)的抗氧化酶NQO1的表達(dá)也均增加。
　　結(jié)論：在VDN誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化中，Nrf2及其下游抗氧化酶NQO1被激活，參與了血管鈣化的發(fā)生。
　　第二部分抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因

4、子Nrf2對高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其分子機(jī)制研究
　　目的：氧化應(yīng)激、凋亡和成骨樣表型轉(zhuǎn)變是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）參與和調(diào)控血管鈣化的主要機(jī)制，作為機(jī)體最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2在氧化應(yīng)激防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用，具有顯著的抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用，同時(shí)最新的研究也發(fā)現(xiàn)，Nrf2是調(diào)控骨代謝和穩(wěn)態(tài)的新型作用因子。本實(shí)驗(yàn)旨在深入探討Nrf2對高磷誘

5、導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：酶解法分離Wistar大鼠的原代血管平滑肌細(xì)胞，分為對照組，鈣化組，Nrf2沉默組和Nrf2激活組。對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，鈣化組的細(xì)胞培養(yǎng)基中給予10mMβ磷酸甘油（βglycerophosphate，βGP）培養(yǎng)，Nrf2激活組細(xì)胞同時(shí)選用特異性的Nrf2激活劑DMF和tBHQ干預(yù)，Nrf2沉默組細(xì)胞應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使Nrf2表達(dá)沉默。應(yīng)用茜素紅染色檢測各組細(xì)胞鈣化程度；

6、應(yīng)用試劑盒檢測各組細(xì)胞ALP活性和鈣含量；應(yīng)用Westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞Nrf2及其下游NQO1和HO1的表達(dá)，以及各組細(xì)胞成骨標(biāo)記BMP2、Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Westernblot分別檢測細(xì)胞凋亡比例及cleaved caspase3的表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀及試劑盒分別檢測細(xì)胞ROS活性和MDA含量。
　　結(jié)果：①與對照組相比，鈣化組細(xì)胞培養(yǎng)10天后茜素紅染色出現(xiàn)

7、明顯的鈣化，細(xì)胞內(nèi)鈣含量和ALP活性均顯著增加，成骨標(biāo)記蛋白BMP2、Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)均顯著增高，細(xì)胞ROS活性及MDA含量顯著上升，cleaved caspase3表達(dá)及細(xì)胞凋亡率也顯著增加。②與對照組相比，Nrf2沉默組Nrf2的mRNA水平降低約70％，Nrf2下游抗氧化酶NQO1和HO1表達(dá)也顯著下降，同時(shí)成骨標(biāo)記蛋白BMP2、Runx2、OPN、βcatenin的表達(dá)均顯著增高，細(xì)胞鈣含量顯著上升。③