母愛剝奪對大鼠自發(fā)活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶的影響及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制.pdf

1、背景與目的:研究表明,人類生命早期應(yīng)激是多種精神疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素,可誘發(fā)重性抑郁癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、兒童注意缺陷癥及精神分裂癥等疾病。關(guān)于其致病機(jī)制的研究,目前主要集中在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),但由于道德的約束及方法學(xué)的限制,以人為對象的研究還是有限的,故為了進(jìn)一步深入、全面地探討生命早期應(yīng)激引起人類精神疾病發(fā)病的機(jī)制,目前的研究主要采用動(dòng)物模型。其中,應(yīng)用于嚙齒類動(dòng)物的母愛剝奪模型,因其符合人類生命早期母子分離的特征,得到了廣泛應(yīng)用,而且關(guān)

2、于其影響機(jī)制的研究,目前主要集中在下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸反應(yīng)性增強(qiáng)和海馬5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)功能的減低等。本課題組的相關(guān)研究也表明,母愛剝奪導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)的5-HT1A受體陽性細(xì)胞數(shù)量減少。隨著神經(jīng)影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展,越來越多的證據(jù)表明抑郁癥等精神疾病不僅僅是一種單純的功能性疾病,其發(fā)病還伴有海馬損傷和齒狀回神經(jīng)元再生障礙等多種神經(jīng)生物學(xué)改變,以及腦部結(jié)構(gòu)改變?nèi)绾ｑR體積縮小等?；趪鴥?nèi)外的研究進(jìn)展和本課題組以往的

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為,人類生命早期應(yīng)激是多種精神和軀體疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素,而多種原因和機(jī)制導(dǎo)致的海馬損傷、齒狀回神經(jīng)元再生障礙以及海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,可能是生命早期應(yīng)激引起精神疾病(尤其是抑郁癥)發(fā)病的重要神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一。因此,本研究以大鼠母愛剝奪建立人類生命早期應(yīng)激的動(dòng)物模型,觀察母愛剝奪對大鼠自發(fā)活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶的影響,并通過對大鼠海馬損傷和齒狀回神經(jīng)元再生的研究,探討該影響的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。同時(shí)本研究也為我們進(jìn)一步深入了解生命早期

4、應(yīng)激在人類精神疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供一定的理論基礎(chǔ),并為幼兒早期教育和心理干預(yù)提供理論指導(dǎo)。
　　材料與方法:健康、性成熟清潔級Sprague-Dawley大鼠,體重200-250g,雌雄各1只同籠飼養(yǎng),待其繁殖,新生雄性大鼠用于實(shí)驗(yàn)研究。母愛剝奪模型分為兩個(gè)階段:(1)母嬰分離階段:從大鼠出生后第3天至21天,每日母嬰分離3小時(shí);(2)隔離飼養(yǎng)階段:經(jīng)歷過母嬰分離的大鼠自第22天斷奶后單籠飼養(yǎng)至第60天。分別在每一階段

5、末(即22日齡和61日齡)實(shí)施自發(fā)活動(dòng)試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn),觀察大鼠的自發(fā)活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶能力。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠斷頭取腦,制作石蠟切片,觀察海馬及齒狀回神經(jīng)元數(shù)量、神經(jīng)元凋亡和齒狀回神經(jīng)元再生情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用EXCEL2003和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±S)表示,進(jìn)行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則應(yīng)用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(QR)]表示,進(jìn)行兩獨(dú)立樣本

6、的非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差別有顯著性。
　　結(jié)果:母愛剝奪組大鼠于出生后的第3-21天和第22-60天分別接受母嬰分離和隔離飼養(yǎng)應(yīng)激,對照組正常飼養(yǎng),分別在22和61日齡測定各組大鼠的自發(fā)活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶能力。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死大鼠取腦,制作石蠟切片,觀察海馬及齒狀回神經(jīng)元數(shù)量和神經(jīng)元凋亡情況。
　　1.母愛剝奪對大鼠自發(fā)活動(dòng)的影響
　?、?2日齡:母愛剝奪組大鼠自發(fā)活動(dòng)總路程和周邊路程較對照組顯著增多(P<0

7、.05),而中央路程、總活動(dòng)時(shí)間、中央時(shí)間和周邊時(shí)間差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明,母嬰分離應(yīng)激導(dǎo)致大鼠自發(fā)活動(dòng)增多,提示母嬰分離應(yīng)激誘發(fā)了大鼠的焦慮樣行為。
　?、?1日齡:母愛剝奪組大鼠自發(fā)活動(dòng)的總活動(dòng)時(shí)間較對照組顯著延長(P<0.01),而其他指標(biāo)差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明,大鼠經(jīng)過母嬰分離和隔離飼養(yǎng)雙重應(yīng)激后,自發(fā)活動(dòng)時(shí)間延長并活動(dòng)遲緩,提示大鼠可能同時(shí)存在焦慮樣和抑郁樣行為。
　　2.母愛剝奪對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響<

8、br>　　Morris水迷宮試驗(yàn)共進(jìn)行5天,前4天為定位航行(place navigation)訓(xùn)練,每日2次,主要反映大鼠的空間學(xué)習(xí)能力,以逃避潛伏期(escape latency,EL)為指標(biāo);第5天為空間探索(spatial probe)試驗(yàn),主要測定大鼠的空間記憶能力,以各象限的游泳時(shí)間、平臺周邊各個(gè)區(qū)域游泳路徑的百分比和穿越原平臺的次數(shù)為指標(biāo)。Morris水迷宮試驗(yàn)分別在22日齡和61日齡開始檢測。
　?、?2日齡:定位

9、航行實(shí)驗(yàn)中,母愛剝奪組大鼠在第三天尋找隱匿平臺的逃避潛伏期顯著延長( P<0.05),綜合四天的平均逃避潛伏期,母愛剝奪組大鼠顯著地長于對照組(P<0.05);空間探索實(shí)驗(yàn)中,母愛剝奪組大鼠在第三象限(目標(biāo)象限)的游泳時(shí)間顯著的低于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明,母愛剝奪組大鼠此階段的Morris水迷宮成績明顯低于對照組,提示母嬰分離損害了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　?、?1日齡:定位航行實(shí)驗(yàn)中,母愛剝奪組大鼠在第一、二、三和第四天

10、尋找隱匿平臺的逃避潛伏期以及四天平均逃避潛伏期均顯著延長(P<0.05或P<0.01);空間探索實(shí)驗(yàn)中,母愛剝奪組大鼠在第四象限的游泳時(shí)間顯著增多(P<0.05);穿越原平臺的次數(shù)顯著減少(P<0.05)。結(jié)果表明,大鼠經(jīng)過母嬰分離和隔離飼養(yǎng)雙重應(yīng)激后,依然存在學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　3.母愛剝奪對大鼠海馬和齒狀回神經(jīng)元數(shù)量的影響
　　行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,分別處死各組大鼠取腦,尼氏染色檢測海馬及齒狀回神經(jīng)元數(shù)量,觀察母愛剝奪對其神

11、經(jīng)元的影響。
　　①22日齡:母愛剝奪組大鼠海馬 CA2、CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著減少(P<0.01)。結(jié)果表明,母嬰分離可導(dǎo)致大鼠海馬部分區(qū)域和齒狀回神經(jīng)元數(shù)量的減少,提示海馬和齒狀回存在損傷。
　?、?1日齡:母愛剝奪大鼠CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量較對照組大鼠明顯減少(P<0.01)。結(jié)果表明,大鼠經(jīng)受母嬰分離應(yīng)激和隔離飼養(yǎng)雙重應(yīng)激后,仍表現(xiàn)為海馬部分區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量的減少,提示海馬依然存在損傷。

12、　　4.母愛剝奪大鼠海馬和齒狀回神經(jīng)元凋亡的影響
　　用TUNEL法檢測22和61日齡海馬及齒狀回神經(jīng)元凋亡情況。
　?、?2日齡:母愛剝奪組大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞凋亡相對陽性率較對照組顯著增多(P<0.05或 P<0.01)。結(jié)果表明,母嬰分離導(dǎo)致大鼠海馬 CA3區(qū)及齒狀回神經(jīng)元凋亡的增加。
　?、?1日齡:母愛剝奪大鼠海馬 CA3區(qū)錐體細(xì)胞凋亡相對陽性率較對照組顯著增多(P<0.05)。結(jié)果表明