幾丁糖對(duì)擴(kuò)張后皮瓣纖維包膜影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)觀察幾丁糖應(yīng)用前后纖維包膜厚度、毛細(xì)血管數(shù)量、膠原蛋白含量及成纖維細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)等的變化規(guī)律，闡明幾丁糖在擴(kuò)張器植入術(shù)后纖維包膜形成過(guò)程中，對(duì)成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及膠原纖維的合成與分泌所產(chǎn)生的影響，從而揭示幾丁糖干預(yù)纖維包膜形成的作用機(jī)理，為臨床解決皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)中因纖維包膜攣縮而導(dǎo)致擴(kuò)張后皮瓣利用率降低這一難題尋求一種新的可行方法提供理論依據(jù)。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔15只

2、雌雄不限，體重近似，稱重編號(hào)。 2.分組 每只新西蘭大白兔背部中段脊柱兩側(cè)旁開(kāi)3cm處，皮下淺筋膜深層剝離足夠大腔隙，兩側(cè)各埋植20ml皮膚軟組織擴(kuò)張器一枚；均將左側(cè)設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)設(shè)為對(duì)照組。 3.擴(kuò)張器植入及注水方法實(shí)驗(yàn)組在腔隙剝離到位后，觀察無(wú)活動(dòng)性出血，將2％醫(yī)用幾丁糖0.5ml注入腔隙內(nèi)，使其涂布均勻，再植入20ml皮膚軟組織擴(kuò)張器一枚；對(duì)照組常規(guī)植入20ml皮膚軟組織擴(kuò)張器一枚。待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物切口愈合拆線

3、后開(kāi)始擴(kuò)張注水，擴(kuò)張方法采用常規(guī)擴(kuò)張：無(wú)麻醉狀態(tài)下注水，視情況3～5天注水?dāng)U張一次，每次注水量根據(jù)皮瓣張力大小而定，以皮瓣指壓反應(yīng)4～5秒為限；同一只新西蘭大白兔的實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)每次注水量相同。每只20ml皮膚軟組織擴(kuò)張器注水達(dá)到40ml后停止注水。 4.取材于停止注水10天后，以10％水合氯醛(8ml/kg)腹腔注射，在全身麻醉狀態(tài)下，切取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組擴(kuò)張器表面相同部位纖維包膜及相同部位4cm×4cm大小帶纖維包膜皮瓣。切

4、取的帶纖維包膜皮瓣標(biāo)本置于滴有液體石蠟的玻片表面，在其自然回縮的第5min照相，用圖像分析法計(jì)算各組織塊收縮率；在取下的大塊纖維包膜標(biāo)本上切取約0.1cmx0.3cm大小的組織塊，以4％中性戊二醛固定，送透射電鏡切片觀察；剩余部分平鋪于無(wú)菌紗布上，絲線縫合固定標(biāo)本四角后，連同無(wú)菌紗布一起浸入中性甲醛固定液，用于制作石蠟切片后分別作常規(guī)HE染色、Masson染色和免疫組化CD34染色。 5.觀測(cè)指標(biāo)(1)收縮率：帶纖維包膜的皮瓣標(biāo)

5、本收縮前均為4cmx4cm，在其自然回縮過(guò)程中的第5min照相，用圖像分析法計(jì)算各組織塊收縮率。對(duì)比觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組擴(kuò)張后帶纖維包膜皮瓣的收縮率變化。(2)光鏡下觀察常規(guī)HE染色切片的組織學(xué)變化，并應(yīng)用纖維標(biāo)尺測(cè)量標(biāo)本纖維包膜厚度；光鏡下觀察Masson染色切片，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本中膠原纖維的含量變化，并應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色標(biāo)本進(jìn)行平均灰度的定量分析，以量化兩組中膠原纖維含量對(duì)比；光鏡下觀察CD34染色切片，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照

6、組纖維包膜中毛細(xì)血管數(shù)量的變化。(3)透射電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本成纖維細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和微絲的變化，以對(duì)比兩組中成纖維細(xì)胞分泌膠原的能力及兩組中成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度的差異。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPASS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果： 1.收縮率 實(shí)驗(yàn)組收縮率為43.371±7.312％，對(duì)照組收縮率為45.637±6.613％兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。

7、 2光鏡觀察 2．1. HE染色及纖維包膜厚度測(cè)定鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中均有大量的成纖維細(xì)胞，并有新生薄壁的毛細(xì)血管散在于視野中；實(shí)驗(yàn)組中幼稚期的成纖維細(xì)胞數(shù)目明顯比對(duì)照組多，可見(jiàn)幼稚期的成纖維細(xì)胞胞體較大，兩端常有突起，胞漿因略呈嗜堿性而略顯藍(lán)色；而對(duì)照組中成熟期的成纖維細(xì)胞即纖維細(xì)胞數(shù)目明顯比實(shí)驗(yàn)組多，可見(jiàn)成熟期的成纖維細(xì)胞因合成分泌前膠原蛋白而在其周?chē)纬赡z原纖維，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，胞漿較少，核較實(shí)驗(yàn)組深染。隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組與

8、對(duì)照組光鏡100倍HE染色切片各15個(gè)視野，應(yīng)用顯微標(biāo)尺測(cè)量HE染色切片中纖維包膜的厚度。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組纖維包膜厚度516.000±128.491μm對(duì)照組纖維包膜厚度833.000±227.379μm兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 2．2. Masson染色及圖像定量分析． 光鏡下觀察Masson染色切片，實(shí)驗(yàn)組：纖維包膜厚度的4/6～5/6呈灰色，其中可見(jiàn)散在的成纖維細(xì)胞，核呈灰黑色，卵圓形，排列疏松

9、；其余1/6～2/6呈綠色，其中成纖維細(xì)胞核呈細(xì)梭形，灰黑色，排列疏松，內(nèi)面可見(jiàn)一層內(nèi)皮細(xì)胞樣內(nèi)襯；對(duì)照組：纖維包膜全層綠色，成纖維細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形，松散分布，有散在內(nèi)皮細(xì)胞樣梭形細(xì)胞。圖像定量分析，實(shí)驗(yàn)組平均灰度170.383±14.313，對(duì)照組平均灰度159.762±10.623，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 2.3. CD34染色及毛細(xì)血管數(shù)量觀察光鏡下CD34染色切片中可見(jiàn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞被標(biāo)記成黃褐色，散在于

10、視野中，隨機(jī)選取光鏡100倍CD34染色切片實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各15個(gè)視野，人工計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)量， 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)血管數(shù)量平均每視野8.200±2.150個(gè)，對(duì)照組平均每視野7.900±1.729個(gè)，兩組比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 3.透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組：成纖維細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成池狀，數(shù)量明顯減少，脫顆粒現(xiàn)象明顯，線粒體部分或大部分嵴融合或消失，偶見(jiàn)正常高爾基氏體，未見(jiàn)或偶見(jiàn)微絲結(jié)構(gòu)，游離核糖體數(shù)

11、量減少；對(duì)照組：成纖維細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少見(jiàn)脫顆?，F(xiàn)象，線粒體嵴基本完整，可見(jiàn)許多明顯的微絲結(jié)構(gòu)，核糖體數(shù)量未見(jiàn)明顯減少。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)幾丁糖通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞分泌膠原、延遲成纖維細(xì)胞分化為纖維細(xì)胞過(guò)程、抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化等作用，使擴(kuò)張后皮瓣的纖維包膜變薄，膠原纖維含量降低，收縮性下降，從而有效減輕了擴(kuò)張后皮瓣的收縮率；同時(shí)由于其不影響隨擴(kuò)張皮瓣面積增大而出現(xiàn)的毛細(xì)血管增生和擴(kuò)張，所以不影響