抑制PI13K-AKT通路提高人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞體外化療的效果.pdf

1、近年來(lái)的研究顯示，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3kinase，PI3K)在腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞在一系列內(nèi)外因素的作用下，通過(guò)啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡。在腫瘤細(xì)胞逃避抗癌藥物的殺傷過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能起了極其重要的作用，因此PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有望成為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)告關(guān)于在肺癌、胃癌、大

2、腸癌等惡性腫瘤中利用PI3K特異性抑制劑LY294002/Wortmannin來(lái)阻斷PI3K/Akt通路，從而提高惡性腫瘤的化療效果和降低惡性腫瘤細(xì)胞的耐藥性。本研究通過(guò)使用化療藥物順鉑(DDP)及替莫唑胺(TMZ)聯(lián)合PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究抑制PI3K/Akt通路后在人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞體外化療中的相關(guān)性作用。
　　 本課題從兩個(gè)方面對(duì)PI3K/Akt通路在人腦

3、膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的作用進(jìn)行研究：①抑制PI3K/Akt通路后對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移及增殖的影響。②抑制PI3K/Akt通路后對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響。
　　 第一部分，抑制PI3K/AKT通路對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移及增殖的影響
　　 目的：研究探討抑制PI3K/Akt通路對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞體外化療中對(duì)細(xì)胞遷移能力及細(xì)胞增殖能力的影響，以及不同濃度的抑制劑對(duì)細(xì)胞遷移能力及細(xì)胞增殖能力的影響。

4、
　　 方法：將培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)期的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞接種于6孔板、96孔板中，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組中不加入任何藥物，處理組又分為單純使用抗腫瘤藥物DDP、TMZ組，抗腫瘤藥物DDP、TMZ聯(lián)合PI3K特異性抑制劑LY294002組，特異性抑制PI3K/Akt通路，其中抗腫瘤藥物濃度始終保持不變（DDP的終溶度為2.5ug/ml，TMZ的終溶度為8.5μg/ml）。劃痕實(shí)驗(yàn)中LY294002的溶度分別為20umol/

5、L、40umol/L;MTT實(shí)驗(yàn)中LY294002的溶度分別為5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L。劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力的改變：MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率變化。
　　 結(jié)果：劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制PI3K/Akt通路能使細(xì)胞遷移能力受到限制，單純使用抗腫瘤藥物組U251細(xì)胞的遷移能力較對(duì)照組減弱；抗腫瘤藥物聯(lián)合LY294002組U251細(xì)胞的遷移能力較單純使用抗腫瘤藥物組的細(xì)胞遷移能力減弱，

6、在一定藥物溶度范圍內(nèi)，且隨著LY294002溶度的增加，細(xì)胞遷移能力逐漸減弱。MTT比色法檢測(cè)U251細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果顯示單純使用抗腫瘤藥物組中U251細(xì)胞增殖抑制率較對(duì)照組有抑制作用；抗腫瘤藥物聯(lián)合LY294002組中U251細(xì)胞增殖抑制率較單純使用抗腫瘤藥物組中U251細(xì)胞增殖抑制率增高，在一定藥物溶度范圍內(nèi)，且隨著LY294002溶度的增加，細(xì)胞增殖抑制率明顯增加；隨著時(shí)間的增加，24h、48h、72h細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加。<

7、br>　　 結(jié)論：1．通過(guò)抑制PI3K/Akt通路能有效的抑制U251細(xì)胞的遷移能力，使U251細(xì)胞遷移受到限制。2．通過(guò)抑制PI3K/Akt通路能有效的抑制U251細(xì)胞增殖，使U251細(xì)胞增殖速度減慢。3．通過(guò)抑制PI3K/Akt通路有效的減弱了U251細(xì)胞的遷移能力、抑制細(xì)胞的增殖速度，說(shuō)明抑制PI3K/Akt通路能有效的提高U251細(xì)胞體外化療的效果。
　　 第二部分，抑制PI3K/AKT通路對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡

8、的影響
　　 目的：研究探討抑制PI3K/Akt通路對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞體外化療中細(xì)胞凋亡的影響，以及不同濃度的抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：將培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的U251細(xì)胞接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和處理組，對(duì)照組中不加入任何藥物，處理組又分為單純使用抗腫瘤藥物DDP、TMZ組；抗腫瘤藥物DDP、TMZ聯(lián)合PI3K特異性抑制劑LY294002組，其中抗腫瘤藥物濃度始終保持不變（DDP的終溶度為2.5

9、ug/ml，TMZ的終溶度為8.5μg/ml）。在流式細(xì)胞術(shù)、原位熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡和RT-PCR檢測(cè)caspase-3，caspase-9mRNA表達(dá)中，LY294002的終溶度均為20umol/L、40umol/L。實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞早期凋亡率；原位熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的情況；RT-PCR檢測(cè)caspase-3，caspase9mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞早期凋亡率結(jié)果顯示

10、對(duì)照組中U251細(xì)胞的早期凋亡率為2.1％，單純使用DDP、TMZ組中U251細(xì)胞的早期凋亡率分別為15.7％、14.5％；抗腫瘤藥物DDP、TMZ聯(lián)合LY294002組中U251細(xì)胞的早期凋亡率分別為18.5％、29.7％;19.6％、35.6％。與對(duì)照組相比，單純使用抗腫瘤藥物組中U251細(xì)胞早期凋亡率較對(duì)照組增高：抗腫瘤藥物聯(lián)合LY294002組較單純使用抗腫瘤藥物組中U251細(xì)胞早期凋亡率增高，在一定藥物溶度范圍內(nèi)，且隨著LY2

11、94002溶度的增加，U251細(xì)胞早期凋亡率明顯增高。原位熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組中U251細(xì)胞早期凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為6個(gè)，壞死陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為2個(gè)，單純使用抗腫瘤藥物組中U251細(xì)胞早期凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為9個(gè)，壞死陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為1個(gè)，抗腫瘤藥物DDP聯(lián)合LY294002組中U251細(xì)胞早期凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為12個(gè)、16個(gè)，壞死陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均為3個(gè)。與對(duì)照組相比，單純使用抗腫瘤藥物組中U251細(xì)胞早期凋亡數(shù)較對(duì)照組增多；抗腫瘤藥

12、物聯(lián)合LY294002組中U251細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞數(shù)較單純使用抗腫瘤藥物組增多，在一定藥物溶度范圍內(nèi)，且隨著LY294002溶度的增加，U251細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞數(shù)增多。RT-PCR結(jié)果顯示通過(guò)抑制PI3K/Akt通路，使caspase-3，caspase-9mRNA表達(dá)量增高。
　　 結(jié)論：1．通過(guò)抑制PI3K/Akt通路能有效增加人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的凋亡，促使U251細(xì)胞凋亡加快。2．通過(guò)抑制PBK/Akt通路有效的促進(jìn)了