大蒜素抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株生長及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 膠質(zhì)瘤是常見的高惡性度的顱內(nèi)腫瘤，雖經(jīng)手術(shù)、放療及化療等綜合治療后，患者的存活率仍低，大多數(shù)患者從確診時(shí)計(jì)算，存活時(shí)間不到1年?；疾『髮?duì)患者和家庭造成極大的身心痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前的治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物很多，但副作用大，加之腫瘤細(xì)胞日益產(chǎn)生的耐藥性，影響了藥物的療效，因此，迫切需要尋找并研制出更好的治療藥物。大蒜中所含的抗癌活性成分．大蒜素，作為一種天然來源的二烯丙基三硫化物(DADS)，有希望成為治療膠

2、質(zhì)瘤的有效藥物。國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大蒜素對(duì)胃癌、肝癌、膀胱癌、白血病等腫瘤細(xì)胞及組織有抑制和殺傷作用。但鮮見對(duì)大蒜素應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬(1)觀察大蒜素對(duì)體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)及細(xì)胞周期的影響，探討大蒜素是否對(duì)U251細(xì)胞株具有增殖抑制作用；(2)觀察大蒜素對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響；(3)觀察大蒜素作用U251細(xì)胞后，bcl-2/bax基因表達(dá)的變化，初步探討大蒜素誘導(dǎo)U251細(xì)

3、胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.CCK-8法檢測不同濃度大蒜素作用12、24、48h后對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響。
　　 2.熒光顯微鏡觀察經(jīng)大蒜素作用24h后的Hoechst33342熒光染色后凋亡細(xì)胞形態(tài)。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)AnnexinV-FITC和PI雙染后的細(xì)胞凋亡率，并檢測細(xì)胞周期的改變。
　　 4.免疫組化法檢測不同濃度大蒜素處理后細(xì)胞的bcl-2和bax基因表達(dá)

4、的灰度值變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.用CCK8-法測定并根據(jù)公式計(jì)算不同濃度、不同作用時(shí)間后的細(xì)胞存活率，所得數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，按檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，可知，不同濃度大蒜素與其對(duì)U251細(xì)胞不同作用時(shí)間的交互效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.659，P=0.128)。故采用無交互效應(yīng)的兩因素方差分析。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，大蒜素對(duì)U251細(xì)胞的作用有時(shí)間依賴性（F=25.307，P＜0.001）和濃度依賴性(F=80

5、.713，P＜0.001)。隨大蒜素作用濃度的增加、作用時(shí)間的延長，U251細(xì)胞受抑制作用越明顯。根據(jù)中效方程式，求出大蒜素作用12、24、48h后U251細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為55.1μg/ml、39.5μg/ml、21.6μg/ml。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測0、40μg/ml大蒜素作用U251細(xì)胞24h后細(xì)胞周期G1、S、G2期分別占的百分比，經(jīng)單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)，得到0pg/ml組G1、S、G

6、2期分別為(54.00±2.01)％、(23.56±1.62)％、(21.26±1.08)％,40μg/ml組G1、S、G2期分別為(67.41±2.14)％、(16.35±2.98)％、(13.90±1.18)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。提示大蒜素作用后，U251細(xì)胞周期中G1期比例升高，S、G2期比例降低。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測濃度為0、20、40μg/ml大蒜素組作用U251細(xì)胞后的凋亡率，經(jīng)單因素方差分析

7、，LSD-t檢驗(yàn)，0、20、40μg/ml大蒜素組的凋亡率分別為（2.54±0.57）％、(28.34±3.53)％、(46.57±2.97)％，各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。提示大蒜素所致U251細(xì)胞凋亡為濃度依賴關(guān)系，大蒜素的作用濃度越高，細(xì)胞凋亡越明顯。因而大蒜素能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 4.40μg/ml大蒜素作用U251細(xì)胞24h后，經(jīng)Hoechst33342熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，可見凋亡細(xì)

8、胞，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮、凝聚，核染色質(zhì)邊集，出現(xiàn)濃染致密的強(qiáng)藍(lán)色顆粒塊熒光信號(hào)。
　　 5.免疫組化法經(jīng)0、20、40μg/ml大蒜素作用24h后，分別測量細(xì)胞漿中bcl-2和bax表達(dá)的灰度值，經(jīng)單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，得到bcl-2表達(dá)的灰度值分別為84.6±3.3、124.6±3.7、147.5±3.3，bax表達(dá)的灰度值分別為154.8±2.8、134.5±4.3、104.5±2.7，各濃度組間比較，有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義(P＜0.001)。隨著大蒜素濃度的增加，bax基因表達(dá)的灰度值下降，bcl-2基因表達(dá)的灰度值升高。說明bax的基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，而bcl-2的基因表達(dá)逐漸減弱。提示大蒜素通過下調(diào)U251細(xì)胞的bcl-2表達(dá)，上調(diào)bax表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1.大蒜素能抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，抑制作用具有濃度、時(shí)間依賴性。
　　 2.大蒜素能誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡，作用強(qiáng)度與其濃度相關(guān)。