小干擾RNA抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞VEGF表達(dá)及腫瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、目的:篩選有效的干擾序列，研究靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的特異性小干擾RNA(siRNA)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中VEGF表達(dá)的抑制作用，探討VEGF對(duì)U251細(xì)胞的作用；裸鼠皮下成瘤直接注射siRNA，研究VEGF的特異性siRNAn寸在體腫瘤生長(zhǎng)的影響，探索膠質(zhì)瘤的抗血管形成的基因治療的給藥途徑。 方法: 一、設(shè)計(jì)并體外化學(xué)合成3對(duì)針對(duì)人VEGF基因的特異性siRNA和綠色熒光素標(biāo)記的FAM-siRNA陰性對(duì)照序

2、列，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U25l細(xì)胞；通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)綠色熒光素的U251細(xì)胞，評(píng)估siRNA的轉(zhuǎn)染效率；利用RT-PCR技術(shù)測(cè)定不同序列的特異性siRNA干擾后VEGFmRNA的表達(dá)水平，篩選具有最大抑制作用的特異性siRNA為最佳序列；RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度的最佳序列的細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSA)測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的VEGF的蛋白水平，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度；流式細(xì)胞儀檢

3、測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。 二、裸鼠皮下接種U251細(xì)胞使其成瘤，分別將2.5ug、4.0ug和5.0ug VEGF-siRNA溶于50ul的生理鹽水中，制成siRNA混懸液，注射在皮下腫瘤的不同部位，通過觀察對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251在裸鼠體內(nèi)致瘤能力的影響及血管新生情況，探討VEGF小分子干擾RNA在膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制，并確定最適宜的給藥量，為膠質(zhì)瘤的基因治療奠定基礎(chǔ)。 結(jié)果: 一、熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)顯示

4、：轉(zhuǎn)染效率達(dá)95％以上；以200nM濃度轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，3對(duì)序列對(duì)VEGF mRNA的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)，其中以siRNA-1下調(diào)VEGF表達(dá)的作用最強(qiáng)，抑制率大于70％，選為最佳特異性siRNA；最佳序列不同濃度梯度下VEGF mRNA的表達(dá)水平可下調(diào)16‰～73％，以200nM濃度為合適轉(zhuǎn)染濃度，使VEGF蛋白表達(dá)減少了62.7％；VEGF表達(dá)水平的下降促進(jìn)IJ251細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染組為63.06±7

5、.12，明顯高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，后兩組分別為28.93±8.35和8.14±1.10。 二、VEGF-siRNA對(duì)體內(nèi)腫瘤的抑制作用在較大劑量應(yīng)用時(shí)才有明顯表現(xiàn)，并且隨著劑量的增大抑制作用不斷增強(qiáng)。2.0ug實(shí)驗(yàn)組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制與對(duì)照組比較不明顯，4.0ug實(shí)驗(yàn)組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率約37.1％，5.0ug實(shí)驗(yàn)組的抑制率達(dá)到了57.4％左右。病理切片顯示瘤體內(nèi)血管數(shù)量減少。 結(jié)論: (1)靶向特異性siR