紫杉醇脂質體與依托泊苷對骨肉瘤細胞株作用的分子機制研究.pdf

1、目的：探討紫杉醇脂質體（paclitaxelliposome）與依托泊苷(etoposideVP-16)對入骨肉瘤細胞株MG-63的細胞毒性及其分子機制的對比研究，為紫杉醇脂質體、依托泊苷治療骨肉瘤的合理性選擇提供實驗依據(jù)。
　　 方法：將MG-63細胞置于37℃、5％CO2飽和濕度的常規(guī)條件下傳代培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期用于實驗。
　　 1藥物的配制：將紫杉醇脂質體用10ml5％葡萄糖注射液稀釋，震蕩器振搖Smin充

2、分混勻后制備成3mg/ml的儲備液，依托泊苷制備成0.02g/ml的儲備液，4℃避光保存。使用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。
　　 2細胞形態(tài)學觀察：將不同濃度的紫杉醇脂質體和依托泊苷分別作用于MG-63細胞24h、48h、72h，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況并照相。
　　 3MTT試驗：調整細胞濃度為5×104/m1，每孔200μ1接種于96孔板，進入對數(shù)生長期后采用四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測不同濃度紫杉

3、醇脂質體(0.1、1、10、100ng/ml)和依托泊苷(6.25、12.5、25、50、10011g/ml)對細胞的生長抑制作用。
　　 4流式細胞儀檢測細胞凋亡：采用不同濃度的紫杉醇脂質體與不同濃度的依托泊菅，藥物作用48h，收集實驗組及對照組細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml，加入1ml冷PBS洗滌二次，分別加入FITC標記的膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)和碘化丙啶（操作按說明書進行），避光室溫反應15min，用Epi

4、c-XLⅣ型流式細胞儀檢測細胞凋亡.
　　 5Western印跡法：觀察IC50的紫杉醇脂質體及IC50的依托泊苷作用人成骨肉瘤細胞MG-6348h后的PCNA、cyclinDl、cyclinE、Bcl-2、Bax的表達。
　　 結果：1.細胞形態(tài)學倒置顯微鏡下觀察，將紫杉醇脂質體按不同濃度(0.1、1、10、100ng/ml)作用于MG-63細胞48h后，可見細胞從梭形慢慢變成圓形，細胞內質聚集，細胞與細胞間距增大，隨

5、著藥物濃度的增加，胞漿內顆粒也隨之增多，細胞與平皿的附著力減弱，出現(xiàn)不同程度的細胞漂浮。對照組細胞形態(tài)生長正常，細胞增殖狀態(tài)良好。不同濃度的依托泊苷作用于MG-63細胞48h后，觀察可出現(xiàn)明顯的受抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用也隨之更加明顯，隨著藥物濃度的增加，變圓的細胞數(shù)量增多。最低濃度的依托泊苷作用48h，仍可見少量細胞的形狀有變化，與對照組相比，細胞生長緩慢甚至停滯，胞漿內顆粒增多增粗，部分細胞脫落，漂浮于培養(yǎng)基中，貼壁

6、的細胞中可見少數(shù)膜破裂壞死。
　　 2MTT結果：不同濃度(0.1、1、10、100ng/ml)紫杉醇脂質體和不同濃度(6.25、12.5、25、50、100ug/ml)依托泊苷分別作用于MG-63細胞24h、48h、72h，MTT結果顯示紫杉醇脂質體和依托泊苷均能明顯抑制MG-63細胞增殖，并呈劑量-時間依賴性(P＜0.05)。
　　 3流式細胞儀的分析結果：經(jīng)不同濃度的紫杉醇脂質體和各濃度的依托泊苷分別處理MG-63

7、細胞48h后，細胞凋亡率分別是(5.2±0.42)％、(7.3±0.14)％、(18.15±0.21)％、(30.2±0.38)％和(5.2±0.28)％、(7.8±0.41)％、(21.8±0.26)％、(32.3±0.45)％、(43.2±0.13)％與對照組相比較，有顯著性差異。由此可見紫杉醇脂質體和依托泊泊苷都可使MG-63細胞發(fā)生凋亡，而且隨著藥物濃度的增加，凋亡率也隨之增加。
　　 4Western-bloting結