PPARδ在角質(zhì)形成細(xì)胞及銀屑病中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、銀屑病是一種自發(fā)性的自身免疫性疾病，影響著約全球約2％的人口，在中國發(fā)病率稍低，但中國人口基數(shù)龐大，有著約500-800萬的銀屑病患者。由于銀屑病目前還不能根治，且特別容易復(fù)發(fā)，給患者身心及家庭帶來了嚴(yán)重的損害。咪喹莫特(imiquimod，IMQ)最初用于治療人皮膚癌和外生殖器/肛周疣等疾病，后被研究者開發(fā)并用在小鼠皮膚上來誘導(dǎo)銀屑病樣的癥狀。由于該模型能很好的誘導(dǎo)出人銀屑病的絕大部分癥狀，且模型簡單易制備，迅速成為研究銀屑病的一個(gè)重

2、要模型。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬于Ⅱ型核受體超家族，可分為3種亞型(PPARα/γ/δ)。PPARδ在代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、脂代謝紊亂等疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPARδ在人銀屑病皮損和IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病皮膚中高表達(dá)，提示其可能在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。目前銀屑病的治療沒有很好的辦法，且不能徹底的

3、治愈，本實(shí)驗(yàn)借助IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠以及人角質(zhì)原代細(xì)胞進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，為PPARδ在銀屑病中的作用提供更為有力和直接的證據(jù)，以期為銀屑病的治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　第一部分 PPARδ在銀屑病皮損中的表達(dá)情況
　　目的:為了考察PPARδ在人和小鼠銀屑病皮損及正常皮膚中的表達(dá)情況，從而為PPARδ在銀屑病中的作用提供依據(jù)。
　　方法:取健康人皮膚和銀屑病人皮損處皮膚，小鼠正常皮膚和IMQ刺激后的皮膚，進(jìn)行免疫組織

4、化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitativepolymerase chain reaction，Q-PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot，WB)實(shí)驗(yàn)，考察PPARδ在正常皮膚和銀屑病皮損中、表皮和真皮層中的表達(dá)差異。并進(jìn)一步探討了PPARδ在銀屑病皮損部位的特異性表達(dá)。
　　結(jié)果:人銀屑病皮損和小鼠經(jīng)IMQ刺激皮膚中的PPARδ表達(dá)較健康皮膚和正常小鼠皮膚均升高

5、。通過IHC染色觀察到，人皮損處的PPARδ主要表達(dá)于表皮上基底層。真皮、表皮的表達(dá)偏好來看，人及小鼠皮膚中PPARδ主要表達(dá)于表皮層，而真皮層中含量很少。PPARδ于健康人皮膚中表達(dá)很少，同時(shí)也很少表達(dá)于其它幾種皮膚疾病的皮損中，表明了PPARδ在銀屑病皮損部位表達(dá)的相對(duì)特異性。
　　結(jié)論:PPARδ在人銀屑病皮損處及IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病皮損中有所升高，表明了PPARδ很可能在銀屑病的發(fā)病中起到了很重要的作用。
　　第二

6、部分 PPARδ對(duì)于原代角質(zhì)細(xì)胞體外分泌細(xì)胞因子的作用
　　目的:考察PPARδ在不同細(xì)胞炎癥模型中所起的作用及其潛在機(jī)制。本部分我們一共借助了三類比較常規(guī)的與銀屑病關(guān)系比較密切的細(xì)胞模型。(1)白介素(interleukin，IL)-17、IL-22和腫瘤壞死因子alpha(tumor necrosis factor，TNF-α)等細(xì)胞因子在銀屑病的發(fā)展中起到重要的作用，我們探尋了PPARδ對(duì)于在這些細(xì)胞因子作用下角質(zhì)細(xì)胞炎癥反

7、應(yīng)的影響。(2)12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(12-O-Yetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)在體內(nèi)也常用于誘導(dǎo)小鼠的銀屑病樣模型，且有報(bào)道稱TPA能有到小鼠皮膚中PPARδ表達(dá)的上調(diào)，在體外實(shí)驗(yàn)中TPA常被用于誘導(dǎo)原代角質(zhì)細(xì)胞的分化，我們預(yù)在本實(shí)驗(yàn)中考察PPARδ是否也對(duì)TPA作用的原代角質(zhì)起到一定的調(diào)控作用。(3) IMQ乳膏溶液作用于角質(zhì)細(xì)胞是最近被研究者開發(fā)并使用的一個(gè)銀屑病細(xì)胞模型，能夠

8、更進(jìn)一步的反應(yīng)銀屑病角質(zhì)細(xì)胞的病理情況，我們預(yù)考察PPARδ在該體外細(xì)胞模型中所起到的作用。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)成功提取了人原代角質(zhì)細(xì)胞，并分別成功構(gòu)建了三種角質(zhì)細(xì)胞炎癥模型。利用Q-PCR、WB等方法考察了PPARδ選擇性激動(dòng)劑GW0742和專一性拮抗劑GSK3787在這些模型中對(duì)炎癥的影響，并進(jìn)一步考察了PPARδ在這一過程中的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)通過實(shí)驗(yàn)在眾多的PPARδ響應(yīng)基因中確定了改變最大的一個(gè)基因:脂質(zhì)分

9、化相關(guān)蛋白（Adipose differentiation-related protein，ADRP），并以它作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中考察PPARδ是否激活的一個(gè)指標(biāo);(2)PPARδ激動(dòng)劑GW0742能加劇IL-17A、IL-22或TNF-α誘導(dǎo)的原代角質(zhì)細(xì)胞炎癥情況;(3) TPA誘導(dǎo)的原代角質(zhì)細(xì)胞炎癥情況不依賴于PPARδ通路，但我們發(fā)現(xiàn)TPA+GW0742能共同激活人黑素瘤缺乏因子2(Absent in Melanoma2，AIM-2)的

10、表達(dá)，而最近有報(bào)道稱AIM-2在銀屑病的發(fā)展中占有一定的作用。(4) PPARδ抑制劑能緩解IMQ誘導(dǎo)的原代角質(zhì)細(xì)胞炎癥情況;
　　結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞模型上驗(yàn)證了PPARδ在銀屑病相關(guān)炎癥方面的作用，首先PPARδ的拮抗劑能降低IL-17、IL-22或TNF-α誘導(dǎo)的炎癥因子的分泌。TPA誘導(dǎo)的原代角質(zhì)細(xì)胞炎癥雖然不依賴于PPARδ，但是當(dāng)TPA和PPARδ的激動(dòng)劑同時(shí)存在時(shí)，AIM-2的表達(dá)被上調(diào)，這說明PPARδ還能在一定

11、的程度上激活一些通路來協(xié)同其它的刺激因素產(chǎn)生其原來所沒有的作用，PPARδ的這一現(xiàn)象也與之前報(bào)道的其能調(diào)控豐富的下游基因的功能相一致。此外，IMQ誘導(dǎo)的原代角質(zhì)細(xì)胞炎癥能夠被PPARδ的激動(dòng)劑加強(qiáng)，同時(shí)能被PPARδ的抑制劑減弱。
　　第三部分 PPARδ在體內(nèi)銀屑病樣小鼠模型中的作用及其機(jī)制研究
　　目的:前面實(shí)驗(yàn)表明PPARδ對(duì)于IMQ誘導(dǎo)的原代細(xì)胞炎癥起到了一定的作用，且PPARδ在銀屑病皮損處高表達(dá)，為了考察PPAR

12、δ在體內(nèi)銀屑病小鼠模型中的作用及其作用機(jī)制，設(shè)計(jì)這一部分實(shí)驗(yàn)。
　　方法:首先配制PPARδ的體內(nèi)注射溶液，在IMQ刺激前2h、刺激后4h、8h注射入小鼠皮下，空白組用PBS代替注射。連續(xù)6天后，處死小鼠取材，皮膚均分為4份，一份檢測(cè)Q-PCR，一份檢測(cè)WB，一份檢測(cè)IHC，一份用作流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)使用。通過H&E染色、IHC染色、Q-PCR、流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)等技術(shù)，我們觀察了小鼠皮膚的病理情況并檢

13、測(cè)了小鼠皮膚中銀屑病相關(guān)炎癥因子及炎癥細(xì)胞的變化情況。對(duì)于PPARδ作用機(jī)制的研究，我們將不同組的小鼠皮膚提取蛋白，進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，篩選信號(hào)通路。
　　結(jié)果:PPARδ專一性拮抗劑GSK3787能下調(diào)IMQ引起的表皮棘層肥厚現(xiàn)象，同時(shí)從H&E的結(jié)果上看，真皮層的浸潤細(xì)胞也有所降低。GSK3787還能降低IMQ引起的IL-17a、IL-23、IL-22和IL-1b等的表達(dá)升高，并且GSK3787的這些作用呈濃度和時(shí)間依賴性。此外，TC

14、Rβ+IL-17A+及TCRγδ+ IL-17A+(T17+)細(xì)胞在IMQ+GSK組也較IMQ組有所下調(diào)。對(duì)于PPARδ在IMQ模型中作用機(jī)制的研究，我們發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT及STAT3信號(hào)通路在模型組小鼠皮損中表達(dá)上調(diào)，我們進(jìn)一步注射該通路蛋白的抑制劑，發(fā)現(xiàn)PPARδ的作用被減弱。
　　結(jié)論:PPARδ拮抗劑能夠緩解IMQ引起的銀屑病樣皮損癥狀，且能降低銀屑病相關(guān)炎癥因子及炎癥細(xì)胞的表達(dá)，提示其可能作為一種潛在的銀屑病治療新靶點(diǎn)

15、。IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮膚炎癥中，PPARδ是通過PI3K-AKT及STAT3通路來發(fā)揮作用的。
　　第四部分阻斷Alox8能減輕IMQ在小鼠皮膚上引起的銀屑病樣反應(yīng)
　　目的:之前的實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)較為深入地探明了PPARδ在銀屑病發(fā)病中的作用，但是PPARδ的內(nèi)源性配體還不是很明確。雖然我們?cè)诘谝徊糠种嘘U明，Alox8/8s-HETE是PPARδ潛在的上游配體中表達(dá)最高的一對(duì)，且有相關(guān)研究表明，Alox8/8s-HETE可

16、能在皮膚炎癥性疾病的發(fā)生中起到一定的作用。但是它們是否真的在體內(nèi)對(duì)PPARδ有這調(diào)控的作用我們還不能肯定，為了進(jìn)一步考察PPARδ的上游配體Alox8對(duì)于PPARδ的潛在調(diào)控作用，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
　　方法:目前由于沒有市售的PPARδ中和性抗體，為了方便Alox8體內(nèi)的阻斷，我們構(gòu)建了慢病毒包裝的Alox8 shRNA干擾序列。我們首先考察了用Alox8 shRNA干擾后，利用Q-PCR實(shí)驗(yàn)方法測(cè)量了PPARδ各響應(yīng)基因的激活情

17、況并用免疫共沉淀的方法考察了PPARδ與RXRa結(jié)合情況的變化。隨后，我們又進(jìn)一步利用Q-PCR法、WB法和FCM的方法考察了Alox8 shRNA干擾后，小鼠皮膚中總體炎癥情況的改變以及銀屑病相關(guān)炎癥蛋白表達(dá)的變化以及炎癥細(xì)胞數(shù)量的改變。
　　結(jié)果:體內(nèi)Alox8 shRNA干擾后，Alox8蛋白的表達(dá)量較陰性對(duì)照序列有所下降，此外，小鼠皮膚內(nèi)PPARδ各響應(yīng)基因的表達(dá)均下調(diào)，其中以ADRP的表達(dá)下降的最多，與體外實(shí)驗(yàn)的趨勢(shì)相近