活性維生素D3骨化三醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞作用的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、銀屑病是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病,給患者的身心帶來極大的痛苦,嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。在銀屑病的治療方面,維生素D3類似物、維A酸的出現(xiàn)都起到了革命性的作用。目前維生素D3類似物為美國(guó)及歐洲的輕、中度銀屑病的第一外用藥,外用第三代維A酸治療尋常型銀屑病也已逐漸被推廣。目前維生素D3類似物及維A酸兩類藥物用于治療銀屑病的作用機(jī)制仍在研究之中。國(guó)內(nèi)外臨床治療銀屑病的過程中,聯(lián)合應(yīng)用維生素D3類似物和維A酸類藥物,能起到降低藥物使用

2、濃度及副作用而增強(qiáng)療效的作用。由此,在蛋白質(zhì)水平上,研究維生素D3類似物、維A酸以及該兩類藥物的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)KC的影響,可為該兩類藥物的作用機(jī)制及其臨床聯(lián)合應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。 本研究應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,通過對(duì)HaCaT細(xì)胞及其藥物誘導(dǎo)后細(xì)胞全蛋白的分析比較,研究骨化三醇、芳維A酸氨丁三醇及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)KC蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,尋找維生素D3類似物及其聯(lián)合芳維A酸氨丁三醇作用機(jī)制的相關(guān)靶蛋白,從而為銀屑病的治療,尤其骨化三

3、醇聯(lián)合維A酸治療,提供理論依據(jù)。 第一部分 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)、藥物干預(yù)及蛋白質(zhì)樣品的制備 目的：人表皮KC(HaCaT 細(xì)胞系)的培養(yǎng)、藥物誘導(dǎo),以及細(xì)胞全蛋白的提取,為后續(xù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供基礎(chǔ)。 方法:HaCaT細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代,待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80％融合,改用無血清的K-CSF培養(yǎng)24小時(shí)后,分別加入新鮮配制的10-8mol/L的骨化三醇、10-7mol/L的AT及兩藥同時(shí)加入,陰性對(duì)照組加等量的無血

4、清K-CSF,每種條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,避光培養(yǎng)48小時(shí)后收集陰性對(duì)照組及各加藥組細(xì)胞,采用反復(fù)凍融法提取細(xì)胞全蛋白,用Bradford法測(cè)定蛋白濃度,蛋白樣品分裝,置-80℃保存。 結(jié)果： 1.采用含9M尿素、4％(W/V)CHAPS等的細(xì)胞裂解液,-80℃冰箱反復(fù)凍融3-4次,四組細(xì)胞提取的全蛋白的濃度較高。 2.骨化三醇與AT對(duì)HaCaT細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；骨化三醇及AT與陰性對(duì)照相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

5、異；兩藥聯(lián)合應(yīng)用可明顯降低細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá),與陰性對(duì)照及兩者單獨(dú)作用時(shí)的蛋白質(zhì)濃度相比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：骨化三醇和AT聯(lián)合作用時(shí)其抑制蛋白質(zhì)表達(dá)的功能強(qiáng)于任一藥物的單獨(dú)作用。 第二部分 HaCaT細(xì)胞全蛋白的2-DE圖譜的建立 目的：建立適用于HaCaT細(xì)胞的分辨率高和重復(fù)性好的2-DE平臺(tái),并使用該平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)第一部分得到的蛋白樣品進(jìn)行二維電泳,得到各組蛋白質(zhì)二維分離的凝膠圖譜。 方法：以固相p

6、H梯度等電聚焦為第一向和垂直SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳為第二向,按照Bio-Rad 2-DE的流程摸索出適用于HaCaT細(xì)胞全蛋白的水化上樣緩沖液濃度、等電聚焦(IE F)電泳程序、高效的二向分離膠凝濃度等條件。然后在同樣條件下對(duì)前期制備的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行固相pH梯度2-DE分離、銀染,并圖像掃描。 結(jié)果：采用長(zhǎng)17cm、pH 3-10,非線性NL預(yù)制膠條,濃度為12％的分離膠,增加上樣緩沖液中DTT的含量,等電聚焦升壓順利,所得

7、圖像縱紋、橫紋少,蛋白點(diǎn)清晰,無明顯脫尾等現(xiàn)象。 結(jié)論：本研究成功建立了HaCaT細(xì)胞全蛋白的2-DE展示平臺(tái),建立了圖像清晰、分辨率高和重復(fù)性好的固相PH梯度2-DE圖譜,得到了較好的蛋白質(zhì)分離及展示效果。 第三部分凝膠圖像的分析和差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定 目的：尋找陰性對(duì)照、骨化三醇、AT及聯(lián)合用藥四組KC蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,揭示骨化三醇、AT藥物作用后蛋白表達(dá)的質(zhì)與量上與正常角質(zhì)細(xì)胞的差異。通過質(zhì)譜分析為差異的蛋

8、白質(zhì)定性,從而揭示藥物作用機(jī)制中的靶蛋白。 方法：使用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件對(duì)2-DE圖譜進(jìn)行匹配分析,并以同實(shí)驗(yàn)條件下的建立的正常角質(zhì)細(xì)胞的2-DE圖譜及人類正常角質(zhì)細(xì)胞2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)果作為參照,篩選出存在差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)。切取符合質(zhì)譜分析濃度要求的10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn),進(jìn)行膠內(nèi)酶解,后通過基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行氨基酸序列分析,依據(jù)酶解肽片

9、斷的質(zhì)量,通過Mascot軟件查詢SWISS-PROT蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),經(jīng)軟件自動(dòng)運(yùn)算得出Mascot得分,確定出被測(cè)蛋白質(zhì)的可能屬性及名稱。 結(jié)果： 1、建立了一個(gè)包含3000余個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的KC的雙向電泳圖譜。四組細(xì)胞的3塊凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為3143±284、3081±404、2930±729、3222±526。 2、同一組細(xì)胞的同一蛋白點(diǎn)在3塊膠的重復(fù)性好,其變異程度的平均值為0.2552。 3、四

10、組數(shù)據(jù)間兩兩比較分析不同藥物作用后的雙向凝膠電泳圖譜,差別1.1倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別有10-38個(gè),其中聯(lián)合用藥組與骨化三醇組以及骨化三醇組和AT組間的差異點(diǎn)較多。 4、送檢10個(gè)蛋白質(zhì),檢測(cè)出4個(gè),分別為:Serpin B1,IRF4的irf結(jié)構(gòu)域立體結(jié)構(gòu)的A鏈,fascin homolog1,還有一種由1081個(gè)氨基酸組成的未命名的蛋白質(zhì)。 結(jié)論：使用ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件對(duì)凝較