紫外線對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)及白藜蘆醇保護(hù)作用的研究.pdf

1、日光中的紫外輻射依據(jù)生物學(xué)作用不同可以分為波長(zhǎng)為320～400nm的長(zhǎng)波紫外線(UVA)、波長(zhǎng)為280～320nm的中波紫外線(UVB)和波長(zhǎng)為200～280nm的短波紫外線(UVC)。臭氧層位于距地表十幾公里以上的對(duì)流層，它像一塊毯子覆蓋在地球上空，可以阻擋100％的UVC和絕大部分的UVA、UVB到達(dá)地面，是地球上生物生命活動(dòng)的天然屏障。自1974年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)臭氧層遭破壞以來(lái)，到目前為止南極和北極都己出現(xiàn)了臭氧空洞。而由于臭氧層的破

2、壞，到達(dá)地面的紫外輻射也隨之增多。表皮是位于人體最外層的天然屏障，是與外界直接接觸的器官，保護(hù)著機(jī)體免受外界不良環(huán)境的侵害。紫外輻射是皮膚接觸的重要的物理因素之一。過(guò)量的紫外輻射可以引起炎癥，紅斑，免疫抑制甚至皮膚癌。早在1997年日本大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)系就通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紫外線能致皮膚癌，在過(guò)去的幾十年里，歐美地區(qū)皮膚癌的發(fā)生率也顯著增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每減少1％臭氧含量，皮膚癌的發(fā)病率將會(huì)增加2％～3％。
　　研究發(fā)現(xiàn)皮膚癌是紫外線導(dǎo)致的D

3、NA損傷和基因突變累積的結(jié)果。DNA是最重要的遺傳物質(zhì)，DNA受損將會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖，是造成突變、癌變和死亡的重要原因。不同波段的UV對(duì)DNA的損傷方式不同，如UVA主要引起間接損傷，UVB、UVC處于紫外線吸收峰附近，可被DNA吸收造成直接損傷，另外UVB也可因產(chǎn)生過(guò)量的ROS造成DNA間接損傷。HaCaT細(xì)胞（人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞），是研究紫外輻射皮膚損傷的理想模型。因此本實(shí)驗(yàn)選取HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了不同紫外

4、波段對(duì)DNA的損傷效應(yīng)。
　　針對(duì)由輻射引起的DNA損傷的防護(hù)，除了紫外織物、物理阻斷劑和化學(xué)吸收劑之外，抗氧化劑一直是研究的熱點(diǎn)。但是現(xiàn)有抗氧化劑會(huì)有不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，尚不夠理想，且每一種抗氧化劑并不能完全消除紫外線的損傷。因此尋找新的抗氧化劑是重要的舉措。白藜蘆醇(resveratrol; RSV)是一種天然酚類化合物，不僅具有抗炎、抗腫瘤、心血管保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)的作用，而且是一種重要的抗氧化劑。因此本實(shí)驗(yàn)從DNA損傷角度檢測(cè)了白藜

5、蘆醇對(duì)紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞DNA損傷的防護(hù)作用并對(duì)其保護(hù)機(jī)制做了初步探索。
　　目的：
　　研究不同劑量和不同波段紫外線對(duì)HaCaT細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)和白藜蘆醇對(duì)紫外線致HaCaT細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　HaCaT細(xì)胞接種于60mm×15mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基含體積分?jǐn)?shù)為10％的小牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、單位為1×105U/

6、L青霉素、質(zhì)量濃度為100mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)貼壁培養(yǎng)。
　　2、紫外線照射
　　培養(yǎng)皿中細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％融合時(shí)棄培養(yǎng)基，用1mlPBS漂洗2遍后加入適量PBS覆蓋細(xì)胞，放在距光源垂直距離為40cm位置進(jìn)行紫外線照射。
　　3、彗星電泳檢測(cè)紫外輻射誘導(dǎo)的DNA損傷
　　選用不同波段UV(UVA、UVB、UVC)為照射源，以不同劑量(0、10、30、

7、50、70、90mJ/cm2)照射HaCaT細(xì)胞后，收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。在堿性裂解液中裂解后解旋，電泳，中和，染色，漂洗。拍照之后進(jìn)行CASP軟件分析。
　　4、彗星電泳檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)紫外輻射誘導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用
　　HaCaT細(xì)胞于UVB或UVC照射前加入不同濃度白藜蘆醇（使用終濃度0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）培養(yǎng)12小時(shí)，棄去含有白藜蘆醇的培養(yǎng)基，1ml PBS漂洗2遍后照射方法同前。

8、選用UVB、UVC為照射光源，照射劑量為30mJ/cm2。照后收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。在堿性裂解液中裂解后解旋，電泳，中和，染色，漂洗。拍照之后進(jìn)行CASP軟件分析。
　　5、彗星電泳檢測(cè)白藜蘆醇和SIRT抑制劑預(yù)處理對(duì)紫外輻射誘導(dǎo)的DNA損傷作用的影響
　　HaCaT細(xì)胞于UVB照射前加入25μmol/L白藜蘆醇、5mmol/L SIRT抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，棄去含舊培養(yǎng)基，1mlPBS漂洗2遍后照射方法同前。選用UVB為

9、照射光源，照射劑量為30mJ/cm2。照后收集細(xì)胞進(jìn)行彗星電泳。
　　6、Western blot(WB)檢測(cè)不同劑量UVB照射后SIRT6基因的表達(dá)變化
　　不同劑量的UVB照射后立即收集細(xì)胞，具體方法是棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，提取細(xì)胞總蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗室溫孵育1h后4度孵育過(guò)夜、TBST漂洗3次、二抗室溫孵育2h、TBST漂洗3次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，并顯影。
　　7、彗星電泳檢測(cè)細(xì)胞

10、轉(zhuǎn)染siSIRT6后對(duì)紫外輻射致DNA損傷的影響
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，選用UVB為照射光源，照射劑量為30mJ/cm2，照射方法同前;照射后立即收取細(xì)胞進(jìn)行彗星電泳。
　　8、qPCR和Western blot檢測(cè)SIRT6基因mRNA水平表達(dá)變化
　　白藜蘆醇和SIRT抑制劑預(yù)處理后，用30mJ/cm2UVB照射HaCaT細(xì)胞后立即收集細(xì)胞，同時(shí)提取蛋白和RNA。Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PC

11、R反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用瓊脂糖水平電泳觀測(cè)測(cè)后，qPCR檢測(cè)SIRT6mRNA水平表達(dá)情況的改變。細(xì)胞收取后，提取細(xì)胞總蛋白定量，Western blot具體方法同上。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，以(x)±s描述，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析;多重比較，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett-T3法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

12、　　結(jié)果：
　　1、0～90mJ/cm2范圍內(nèi)，未見UVA對(duì)HaCaT細(xì)胞DNA分子的損傷。選用UVB、UVC為照射光源進(jìn)行不同劑量照射時(shí)，兩組均呈現(xiàn)隨照射劑量增加，彗尾加長(zhǎng)，尾部熒光加強(qiáng)。TailDNA％、TailLength、CometLength、TailMoment、OliveTailMoment五個(gè)特異指標(biāo)表征，UVB、UVC照射HaCaT細(xì)胞后，從最小劑量10mJ/cm2開始，實(shí)驗(yàn)組五項(xiàng)指標(biāo)均大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、意義，且各個(gè)檢測(cè)參數(shù)隨照射劑量增加表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。UVB和UVC兩照射組相比，相同劑量照射時(shí)，UVC組彗尾更長(zhǎng)，尾部熒光更強(qiáng)，各指標(biāo)值均大于UVB照射組。
　　2、單用白藜蘆醇處理正常HaCaT細(xì)胞，不會(huì)引起明顯的DNA損傷，即使用10μmol/L的白藜蘆醇處理HaCaT細(xì)胞12h，進(jìn)行彗星電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組各個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。
　　3、白藜蘆醇預(yù)處理后再進(jìn)行30mJ/cm2的UVB照射，彗星結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)

14、照組，UVB照射后HaCaT細(xì)胞DNA出現(xiàn)拖尾，尾部熒光加強(qiáng);當(dāng)加入不同濃度白藜蘆醇預(yù)處理后再進(jìn)行UVB照射，其彗尾減小，尾部熒光減弱，與單獨(dú)UVB照射組相比， TailDNA％、TailLength、ComeLength、TailMoment、OliveTailMoment五個(gè)指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且0.1μmol/L白藜蘆醇處理組與UVB組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、白藜蘆醇預(yù)處理后再進(jìn)行30mJ/cm2的UVC照射，結(jié)果顯

15、示相對(duì)于單獨(dú)照射組，其彗尾減小，尾部熒光減弱。與單獨(dú)照射組相比，白藜蘆醇處理后各個(gè)指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)，且在用0.1μmol/L或10μmol/L白藜蘆醇處理后與UVC組相比各指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)用1μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理后與UVC組相比TailDNA％、CometLength指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、當(dāng)用30mJ/cm2UVB照射HaCaT細(xì)胞時(shí)，出現(xiàn)拖尾，尾部熒光變強(qiáng);用25μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理后再用UV

16、B照射則較UVB組拖尾減小，尾部熒光減弱;當(dāng)加入5mM SIRT抑制劑后再照射UVB時(shí)，彗星拖尾較之于單獨(dú)UVB照射組，拖尾明顯加長(zhǎng)，尾部熒光加強(qiáng)，TailDNA％、TailLength、CometLength、TailMoment、OliveTailMoment五個(gè)特異指標(biāo)表征均增大。
　　6、Western blot檢測(cè)顯示不同劑量UVB照射后，SIRT6表達(dá)升高，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。
　　7、彗星電泳顯示siSIRT6+U

17、VB組較siNC+UVB組，彗尾加長(zhǎng)，尾部熒光加強(qiáng);五個(gè)特異指標(biāo)明顯增大，提示損傷加重。
　　8、qPCR和western blot檢測(cè)白藜蘆醇處理組和白藜蘆醇+UVB組中SIRT6基因的應(yīng)激反應(yīng)表達(dá)情況，結(jié)果看出UVB照射引起SIRT6應(yīng)激性升高;用不同濃度白藜蘆醇處理后SIRT6的表達(dá)水平也升高，且不同濃度白藜蘆醇處理后再用UVB照射SIRT6基因應(yīng)激性升高更加明顯。
　　結(jié)論：
　　1、在研究范圍內(nèi)，以彗星電泳為