禽傳染性支氣管炎病毒M基因在畢赤酵母中表達與蛋白活性檢測.pdf

1、本文根據本課題組在GenBank中注冊的禽傳染性支氣管炎病毒中國分離株SAIBK株的M基因序列(注冊號AY302742)及畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K的序列設計引物，通過雞胚培養(yǎng)收獲禽傳染性支氣管炎病毒，提取病毒RNA，用RT-PCR方法擴增出IBV M基因，構建了克隆載體pMD18-M，通過菌落PCR和酶切對克隆載體進行了鑒定。將克隆載體pMD18-M和酵母表達載體pPIC9K分別用限制性內切酶EcoR I和Not I進行雙酶切

2、，回收目的片段，用T4 DNA連接酶將兩者連接后轉化大腸桿菌，篩選得到酵母表達載體，經酶切鑒定M基因已經正確地連接到pPIC9K上。用限制性內切酶Sac I將表達質粒pPIC9K-M線性化，然后用電轉化的方法導入畢赤酵母GS115中。將在MD平板上生長的轉化子經過PCR鑒定、表型篩選和不同G418抗性濃度篩選后，獲得整合型陽性重組菌株，命名為GS115/pPIC9K-MHis<'+>.Mut<'+>。將重組菌株在1％的甲醇中進行誘導分泌

3、表達，通過收集不同時間段的表達產物進行SDS-PAGE分析表明，在誘導72小時后目的蛋白表達量最大，表達蛋白占上清中總蛋白量的13.3％，表達蛋白的分子量約為33KD。 通過Western-blot檢測顯示，表達蛋白能與IBV陽性血清特異性結合。對表達蛋白進行初步純化后，以M蛋白為包被抗原的ELISA檢測結果顯示表達蛋白與特異性抗體反應良好，表明表達的M蛋白生物學活性良好。目前國內外還沒有利用畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K來