禽傳染性支氣管炎病毒s基因與豬iggfc基因的克隆及在hela細(xì)胞中的融合表達(dá)

1、禽傳染性支氣管炎病毒S1基因與豬IgGFc 基因的克隆及在Hela 細(xì)胞中的融合表達(dá),,,背景綜述目的及意義技術(shù)路線研究內(nèi)容結(jié)果與分析致謝,報告提綱,,背景綜述,病 原 體：IBV（單股正鏈RNA病毒，有囊膜）流行病學(xué)：呼吸道排毒;飛沫傳播；潛伏期短；急性， 高度 接觸性；自然感染僅發(fā)生 于雞,雛雞發(fā) 病最為嚴(yán)重；低溫是發(fā)病的關(guān)鍵。臨床癥狀：損害呼

2、吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等； 呼吸型、腎型、腺胃型等；檢測診斷：病毒分離、病毒中和、血凝抑制試驗、RT－ PCR；ELISA、AGP防 治： 預(yù)防為主（環(huán)境＋疫苗），治療為輔,,禽傳染性支氣管炎(IB),結(jié)合受體，誘導(dǎo)中和抗體、血抑抗體、CTL反應(yīng),S蛋白,E蛋白,M蛋白,N蛋白,infectious bronchitis virus IBV,參與病毒裝

3、配（與核衣殼相互作用，將其結(jié)合到囊膜 ）,具有大量抗原決定簇，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體,參與病毒粒子的釋放,IBV病毒粒子結(jié)構(gòu),背景綜述,,背景綜述,,S 蛋白：裂解為S1(90kD)和S2(84kD)的兩個亞單位， 均為糖蛋白。S1蛋白：由520～538個氨基 酸組成。S1功能：別并結(jié)合宿主細(xì)胞膜上特異性糖蛋白受體 參與膜融合 氨基端參與決定毒株的組織親和性及毒力 抑

4、制多數(shù)中和抗體,IBV S1蛋白,背景綜述,IgG 水解: 2 Fab +Fc 大小相近,活性不同F(xiàn)ab：結(jié)合抗原Fc：結(jié)合活化補(bǔ)體 哺乳動物IgGFc 段能與SPA、SPG非特異性結(jié)合;將目的基因與IgGFc 基因融合表達(dá)，利于鑒定和純化！,,,免疫球蛋白IgGFc段,,IgGFc,目的及意義,克隆豬IgGFc 和IBV S1基因，為進(jìn)一步開發(fā)以這兩個基因為基礎(chǔ)的疫苗和診斷方法做基礎(chǔ)。 表達(dá)S

5、1-IgGFc，以IgGFc為蛋白標(biāo)簽，以期進(jìn)一步利用親合層析或免疫沉淀法，進(jìn)行IBV細(xì)胞受體的分離與鑒定 。,,技術(shù)路線,,研究內(nèi)容,一. 豬IgGFc 基因的克隆和序列分析二. IBV S1基因的克隆和序列分析三. 表達(dá)載體的構(gòu)建四. 重組表達(dá)載體在 Hela 細(xì)胞上的表達(dá),,結(jié)果與分析,豬IgGFc 基因擴(kuò)增,一. 豬IgGFc 基因的克隆和序列分析,擴(kuò)增區(qū)域：鉸鏈區(qū)——C末端 不包括信號肽目的片段：1

6、002 bp 上 游：EcoRI 位點下 游：XhoI 位點,豬IgGFc 基因的RT-PCR擴(kuò)增,pMD18T－IgGFc 構(gòu)建,圖 pMD18T-IgGFc/EcoRI+XhoI酶切,鑒定:EcoRI+ XhoI陽性：2680bp+1002bp,豬IgGFc 基因的克隆和序列分析,IgGFc 序列分析,測序結(jié)果：所獲序列(略)1002 bp，與預(yù)期一致，無終止子，334個氨基酸Blast比對：100％

7、gi5052049, gi47523191, gi43312794% gi33125蛋白預(yù)測：分子量大小約37 kD等電點為6.58在體內(nèi)半衰期約100h，不含跨膜區(qū)不含信號肽，與預(yù)期相符,豬IgGFc 基因的克隆和序列分析,二. IBV S1基因的克隆和序列分析,IBV S1基因的克隆,S1基因PCR產(chǎn)物的電泳分析,模板：含M41株S全長的質(zhì)粒目的：19～536氨基酸上游 BamHI，下游EcoRI去掉了

8、信號肽保留裂解識別位點部分堿基，以增加空間距離,pMD18T-S1構(gòu)建,pMD18T-S1鑒定鑒定:BamHI+EcoRI預(yù)期:2680 bp＋1554bp,pMD18T-S1 BamHI+EcoRI酶切,禽IBVS1基因的克隆和序列分析,IBV S1序列分析,測序：所獲序列（略）大小1554 bp，與預(yù)期一致，無中止子，含518個氨基酸Blast：99％ AY561712.1 （ M41株S1基因）蛋白預(yù)測：穩(wěn)定蛋白

9、等電點8.17，分子量為58.9 kD，在哺乳動物體內(nèi)半衰期超過30h不含跨膜區(qū)沒有信號肽,禽IBVS1基因的克隆和序列分析,三. 載體構(gòu)建,載體構(gòu)建流程圖,順序選擇：S1位于上游S1功能區(qū)N端,,pcDNA3.1-IgGFc 的構(gòu)建,pcDNA3.1-IgGFc雙酶切:XhoI+ EcoRI預(yù)期帶:5.5kb＋1kb,pcDNA3.1-IgGFc 經(jīng)XhoI＋EcoR I酶切,表達(dá)載體的構(gòu)建,pcDNA3.1-IgGF

10、cS1的構(gòu)建,BamHI + XhoI: 5.5kb＋2.6kbNdeI 酶切鑒定: 800 bp＋1600bp＋5600bp,pcDNA3.1-IgGFcS1/BamHI+XhoI,pcDNA3.1-IgGFcS1/ NdeⅠ,表達(dá)載體的構(gòu)建,四. 重組載體在Hela 細(xì)胞上的表達(dá),一抗：兔抗IBV陽性血清二抗：羊抗兔二抗熒光二抗結(jié)果：試驗組觀察到特異性綠色熒光，對照組無綠熒光表明：IBVS1基因在 Hela 細(xì)胞中

11、獲得了表達(dá)，且有活性,間接免疫熒光檢測IBV S1基因在Hela 細(xì)胞上的表達(dá),IFA檢測IBV S1基因的表達(dá),直接檢測IgGFc 的表達(dá),方法：直接免疫熒光二抗：羊抗豬二抗結(jié)果：試驗組有較明顯的綠熒光，而對照組無。表明：IgGFc 基因在Hela 細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)，且有活性,直接免疫熒光檢測IgGFc 基因在Hela 細(xì)胞上的表達(dá),重組載體在Hela 細(xì)胞上的表達(dá),斑點雜交檢測,方法：Dot-blot（直接和間接）裂解液：都能

12、檢測到強(qiáng)烈的陽性反應(yīng)上清：檢測不到陽性反應(yīng)表明：細(xì)胞內(nèi)表達(dá),產(chǎn)物兼具IBV S1和IgGFc 活性,斑點雜交檢測IgGFcS1基因在Hela 細(xì)胞上的融合表達(dá)A, B: 為直接檢測結(jié)果 C, D:間接檢測結(jié)果,重組載體在Hela 細(xì)胞上的表達(dá),小結(jié),通過RT-PCR從豬肝臟總RNA中擴(kuò)增到 IgGFc 基因，并進(jìn)行測序和序列分析。PCR擴(kuò)增得到禽傳染性支氣管炎病毒S1基因 進(jìn)行測序和序列分析。構(gòu)建了IBV S1基因和豬

13、 IgGFc 基因融合表達(dá)的真核表達(dá)載體，并在Hela 細(xì)胞上實現(xiàn)了其融合表達(dá)。經(jīng)檢測，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞內(nèi)，且同時具有IBVS1活性和 IgGFc 活性。,,致謝,本論文是在導(dǎo)師郭愛珍教授和譚亞娣副教授的悉心指導(dǎo)下完成的，從論文的選題、試驗的設(shè)計與實施到論文的寫作無不凝聚著導(dǎo)師的智慧和心血。在此，向兩位老師表示最誠摯的敬意和忠心的感謝！ 感謝實驗室所有老師、同學(xué)、工作人員，謝謝你們?nèi)陙韺ξ业年P(guān)心、教導(dǎo)和幫助