蘇云金芽胞桿菌Cry1Ac蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的定點(diǎn)突變及結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)是應(yīng)用范圍最廣的殺蟲微生物，其殺蟲活性主要來源于芽胞形成過程中產(chǎn)生的晶體蛋白，研究殺蟲晶體蛋白的分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系越來越受到重視。運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)和結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)研究，將有助于明確和闡釋伴胞晶體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。
　　本文運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)，證實(shí)β20-β21 loop為Cry1Ac5蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ中獨(dú)特的功能環(huán)，通過定點(diǎn)突變技術(shù)研究了β20-β21 loop的結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系，獲得了毒力或穩(wěn)

2、定性提高的突變子，研究?jī)?nèi)容如下:
　　比較了Cry1A蛋白的各級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步分析Cry1蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的進(jìn)化樹，確定Cry1Ac5蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅲ作為研究對(duì)象。分析Cry1Ac5結(jié)構(gòu)域Ⅲ及其β20-β21 loop的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在H518FPST522、N543WGNSSI549、F578TSSLGN584等區(qū)域不同于其它Cry1A蛋白，Cry1Ac5的β20-β21 loop含有高度保守苯丙氨酸、絲氨酸及甘氨酸殘基的F578、S581

3、、G583，由此推測(cè)F578、S581、G583這三個(gè)位點(diǎn)極有可能是關(guān)鍵位點(diǎn)， Cry1Ac5蛋白β20-β21 Loop結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及蛋白構(gòu)象的改變可能此有關(guān)，確定以β20-β21 loop為關(guān)鍵，通過定點(diǎn)突變研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。
　　運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)Cry1Ac5的蛋白結(jié)構(gòu)β20-β21 loop上10個(gè)殘基進(jìn)行丙氨酸掃描突變，所有突變子包括(N576A、F578A、T579A、S580A、S581A、L582A、G58

4、3A、N584A、I585A、V586A)都能表達(dá)130 kDa蛋白和產(chǎn)生菱形晶體，室內(nèi)生測(cè)表明，突變子I585A和S581A對(duì)棉鈴蟲的毒力分別提高了1.86倍和1.45倍，而突變子G583A對(duì)棉鈴蟲的毒力則下降明顯，其余突變子的毒性也有所下降。對(duì)Cry1Ac5蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，野生型Cry1Ac蛋白的579、580、582、585位置氨基酸的側(cè)鏈的側(cè)鏈向外伸向Cry1Ac5蛋白分子的表面，Cry1 Ac5蛋白和其受體的相互作

5、用很可能與T579A、S580A、L582A、I585A的功能有關(guān)，而其余位置的側(cè)鏈向內(nèi)伸向蛋白分子內(nèi)側(cè)，可能與維持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān)。
　　對(duì)I585進(jìn)一步突變，構(gòu)建、表達(dá)了I585E、I585F、I585T、I585V突變子，并對(duì)其進(jìn)行了毒力測(cè)定:I585F、I585E、I585T的毒力下降明顯，而I585V的毒力只略有下降;對(duì)I585突變子進(jìn)行了蛋白酶穩(wěn)定性和存貯穩(wěn)定性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)I585E、I585T、I585F的蛋白

6、酶及存貯穩(wěn)定性降低，而I585A的蛋白酶及存貯穩(wěn)定性均明顯提高;I585位的側(cè)鏈對(duì)Cry1 Ac5蛋白穩(wěn)定產(chǎn)生了不利影響，對(duì)比野生型Cry1Ac5、I585A的晶體形態(tài)及殺蟲活性，發(fā)現(xiàn)I585A殺蟲活性高出野生Cry1Ac1.7倍以上。
　　本研究第一次發(fā)現(xiàn)了Cry1Ac5此蛋白其結(jié)構(gòu)域Ⅲ上的β20-β21loop結(jié)構(gòu)的獨(dú)特之處，并且，首次報(bào)道Cry1Ac5蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ中的β20-β21 loop結(jié)構(gòu)在Cry1Ac5蛋白功能中發(fā)揮