rhBMP-2和rhBMP-7誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：利用具有誘導(dǎo)成骨活性的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（rhBMP-7）在體外誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)成骨，觀察BM-MSC的生長形態(tài)特征和增殖情況，并檢測相關(guān)的成骨指標(biāo)，從而了解在外源生長因子的刺激下BM-MSC的生長形態(tài)特征及不同種類和濃度的rhBMP的體外誘導(dǎo)成骨能力，為后續(xù)利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行骨質(zhì)修復(fù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：抽取兔股骨骨髓，利用改進(jìn)的全骨髓貼壁細(xì)

2、胞分離法從骨髓中分離出兔BM-MSC，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，觀察其生長形態(tài)特征，并用含10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的rhBMP-2和rhBMP-7的培養(yǎng)液分別對BM-MSC進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo)，每天觀察其形態(tài)變化，并于第2、4、6、8天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，比較其增殖情況。同時在加入rhBMP后的第4、7、10、14、18天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，定量檢測成骨指標(biāo)堿性磷酸酶和骨鈣素，同時設(shè)僅加基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的BM-MSC作為對照組。

3、　　 結(jié)果：
　　 1.采用改進(jìn)的全骨髓貼壁細(xì)胞分離法成功分離培養(yǎng)了兔BM-MSC。對傳2代BM-MSC進(jìn)行熒光免疫染色，CD44表達(dá)陽性，CD45表達(dá)陰性，對原代及傳4代的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，CD29和CD44表達(dá)陽性，CD45表達(dá)陰性，與間充質(zhì)干細(xì)胞表型相符合。
　　 2.BM-MSC在rhBMP-2和rhBMP-7的誘導(dǎo)下定向分化為成骨樣細(xì)胞。培養(yǎng)過程中，可見貼壁細(xì)胞逐漸由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，出現(xiàn)細(xì)胞聚集，

4、胞質(zhì)變深，含粗大顆粒。
　　 3.與對照組比較，10ng/ml rhBMP-2、10ng/ml rhBMP-7和100ng/ml rhBMP-7組細(xì)胞數(shù)無明顯差別，對BM-MSC的增殖無促進(jìn)作用。而50ng/ml rhBMP-2、100ng/ml rhBMP-2和50ng/ml rhBMP-7組與對照組比較，細(xì)胞數(shù)明顯增多，對BM-MSC的增殖有著促進(jìn)作用，100ng/ml rhBMP-2對BM-MSC的增殖最強(qiáng)。
　　

5、 4.對收集的第4、7、10、14、18天的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行成骨指標(biāo)ALP活性和OC含量的檢測，顯示100ng/ml的rhBMP-2的誘導(dǎo)成骨活性最高。
　　 結(jié)論：通過改進(jìn)的全骨髓貼壁細(xì)胞分離培養(yǎng)法能獲得較高純度的具有間充質(zhì)細(xì)胞表型的兔BM-MSC，以此獲得的BM-MSC在體外培養(yǎng)條件下可大量增殖。rhBMP-2和rhBMP-7具有促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)成骨作用，可使BM-MSC定向向成骨細(xì)胞分化。這為后續(xù)應(yīng)用BM-MSC修復(fù)動物的