免骨髓間充質(zhì)干細胞片(MSCs)包裹新型rhBMP-2-硫酸鈣支架修復兔大段尺骨缺損的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 隨著我國經(jīng)濟和交通的高速發(fā)展,高能量的各種車禍傷創(chuàng)傷等所導致的骨缺損越來越多;以及骨組織感染、腫瘤切除和發(fā)育異常等疾病等導致的骨缺損發(fā)病率也在增高。這不僅給患者和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔,而且也嚴重影響患者的生活質(zhì)量,是臨床治療的難題。目前,臨床多采用新鮮自體骨移植治療,但由于骨來源的限制、二次損傷及治療相關(guān)并發(fā)癥等問題,限制了該方法的廣泛應用。因此,研究新的治療策略已十分必要。最近,組織工程技術(shù)的發(fā)展為治療大段

2、骨缺損提出了新的思路,即將活細胞體外培養(yǎng)擴增后接種于某些特殊支架材料上,以構(gòu)建生物人工組織,植入受體后在局部微環(huán)境的作用下發(fā)揮細胞的成骨效應。
　　 目的:
　　 研究復合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣支架體外對骨髓間充質(zhì)干細胞分化的影響;其次,在體內(nèi),研究骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)包裹的復合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣人工骨支架修復兔長骨骨缺損的作用與效果。
　　 方法:

3、
　　 1.兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng):8周齡雄性新西蘭大白兔15只,每只動物均行雙側(cè)髂骨骨髓穿刺抽取骨髓,體外密度梯度離心法聯(lián)合細胞貼壁法分離培養(yǎng)擴增新西蘭兔MSCs。2.支架對MSCs的成骨分化:將材料做成直徑6mm,厚度2mm的圓盤狀,放在培養(yǎng)板中,種上密度為5000個/cm2的細胞,常規(guī)進行貼壁培養(yǎng)7天、14天后對細胞的堿性磷酸酶含量進行測定。3.干細胞片的制作:將密度為50000個/cm2的細胞懸液用培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)

4、2-3周,直至形成細胞薄片。將細胞片包裹在硫酸鈣支架上備有。4.兔骨缺損修復:選用20只新西蘭大白兔,制成單側(cè)前肢15mm的尺骨骨缺損模型,隨機分為四組:A組植入單純硫酸鈣支架;B組植入復合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣支架;C組植入經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)包裹的硫酸鈣支架;D組植入骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)包裹的復合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸鈣支架。在術(shù)后4周隨機處死動物,作下列檢測:大體

5、觀察、X線檢查、microCT、組織學檢測、X線片的計算機圖像分析、microCT的骨量分析、組織切片的計算機圖像分析并對以上結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外7天測得堿性磷酸酶含量(nmol/s/mg蛋白)為:rhBMP-2-硫酸鈣支架組含量為0.51±0.08,比單純的硫酸鈣組(含量為:0.30±0.03)明顯升高(p＜0.05);在14天時,堿性磷酸酶含量rhBMP-2-硫酸鈣支架組(1.22±0.

6、21)明顯高于單純硫酸鈣組(0.42±0.04),P＜0.05;但是,在兩個時間點上無論是rhBMP-2-硫酸鈣支架組還是單純硫酸鈣支架組的堿性磷酸酶含量都明顯高于單純培養(yǎng)瓶組(P＜0.05)。
　　 2.標本大體觀察:A組缺損大部分由纖維組織連接;B組與C組大體上區(qū)別不大,兩組的缺損外緣和中間有很多纖維組織,緊靠撓骨處和兩個斷端周圍都有一定量的骨組織存在;D組缺損幾乎都被大量骨組織替代;3.X線檢查示:B組與C組無明顯差別,但

7、是都優(yōu)于A組(p＜0.05);D組優(yōu)于B組和C組(P＜0.05)。X線評分所示:D組＞B組≈C組＞A組。4.microCT與骨量分析:在四周后,各組硫酸鈣大部分都已經(jīng)吸收,A組骨組織非常有限;而B組和C組CT掃描顯示有大量骨痂生成,但是在缺損中心以及遠離撓骨一側(cè)的缺損處骨量很少,并且髓腔結(jié)構(gòu)不明顯;在D組,大量骨痂形成,并且骨缺損已經(jīng)成骨性愈合,可見大部分髓腔陰影。CT骨量分析示:B組與C組無明顯差別,但是都優(yōu)于A組(p＜0.05);D

8、組優(yōu)于B組和C組(P＜0.05)。5.組織學切片與組織學半定量:組織切片結(jié)果與microCT相似,組織半定量也顯示B組與C組無明顯差別,但是都優(yōu)于A組(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.證明硫酸鈣支架是生長因子rhBMP-2的良好載體,并可以作為間充質(zhì)干細胞片附著的良好支架。2.骨髓間充質(zhì)干細胞片的移植可以有效地促進新骨的生成及骨缺損的愈合。3.rhBMP-2復合硫酸鈣誘導成骨的作用也非常明顯。4.結(jié)論也說明MS