利用U2-OS細胞表達rhBMP-7的研究.pdf

1、人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（Human bone morphogenetic protein-7，hBMP-7），又名成骨蛋白-1（Osteogenic Protein，OP-1），屬于轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族。hBMP-7能夠誘導動物或人間充質干細胞分化為骨、軟骨、韌帶、肌腱和神經(jīng)組織，在臨床骨科領域中具有廣闊的應用前景，可用于促進脊柱融合和治療骨折、骨缺損、骨不連、股骨

2、頭缺血性壞死等。但是，在基因工程表達該蛋白的過程中遇到了一些難以克服的難題。原核表達系統(tǒng)由于缺乏翻譯后加工、修飾機制，使表達的蛋白復性困難;畢赤酵母的糖基化形式與人類存在差異亦不利于該蛋白的表達;CHO細胞表達的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（rhBMP-7）雖有活性，但是表達量很低，尚不具備產(chǎn)業(yè)化條件，因此，國內外生產(chǎn)此蛋白的公司極少，價格昂貴。所以，能否克服如上困難是rhBMP-7能否真正實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關鍵。
　　目的：人源癌細胞具有

3、完整的翻譯后加工機制、可無限增殖和體外易培養(yǎng)的特點，能否讓其“棄惡從善”用于表達具有臨床應用價值、結構復雜的蛋白質是一個具有挑戰(zhàn)性的課題。本研究擬利用人源癌細胞U2-OS進行rhBMP-7蛋白的表達，以探討人骨肉瘤U2-OS細胞作為表達系統(tǒng)表達rhBMP-7的可行性，本研究有可能為復雜結構蛋白質的高效表達提供一種新的解決方案。
　　方法：⑴rhBMP-7在U2-OS細胞中的表達:構建真核表達質粒pcDNA3.1-rhBMP-7，利

4、用Lipofectamine2000將真核表達質粒轉染至U2-OS細胞中，采用實時熒光定量PCR法檢測rhBMP-7基因在mRNA水平上的表達;Western Blot法檢測rhBMP-7的表達。⑵分泌性rhBMP-7的表達:分析三種信號肽（hBMP-7自身信號肽B7、人基質金屬蛋白酶-9信號肽M9、人纖溶酶原信號肽SP）對U2-OS細胞分泌表達rhBMP-7的影響。構建真核表達質粒pcDNA3.1-rhB7-hBMP7、pcDNA3.

5、1-rhSP-hBMP7、pcDNA3.1-rhM9-hBMP7。利用Lipofectamine2000將真核表達質粒轉染至U2-OS細胞中，采用實時熒光定量PCR法檢測rhBMP-7基因在mRNA水平上的表達，Western Blot法檢測U2-OS細胞內與其培養(yǎng)基中分泌表達的rhBMP-7。在Western Blot檢測分泌表達的rhBMP-7的基礎上進一步利用ELISA檢測U2-OS細胞內與細胞外分泌表達的rhBMP-7。⑶rhB

6、MP-7的純化與分析:選用親和層析法純化細胞分泌表達的rhBMP-7蛋白;通過糖苷內切酶酶切樣品rhBMP-7，對其進行糖基化分析;純化的rhBMP-7作用于NIH3T3細胞，通過檢測NIH3T3細胞的ALP活性，分析rhBMP-7的生物活性。
　　結果：①Western Blot結果顯示rhBMP-7蛋白分子量為65-75KDa，實驗組細胞中rhBMP-7表達量高于陰性對照組。結果表明rhBMP-7可在U2-OS細胞中表達。②研

7、究分泌性rhBMP-7的表達中，通過Western Blot與ELISA檢測U2-OS細胞內與細胞外分泌表達的rhBMP-7，結果表明U2-OS細胞內與細胞外均有表達rhBMP-7。ELISA結果顯示細胞外表達的rhBMP-7蛋白量高于細胞內表達的rhBMP-7，說明rhBMP-7實現(xiàn)了分泌表達，而且hBMP-7自身信號肽引導的U2-OS細胞分泌表達的rhBMP-7蛋白量較高。③經(jīng)鎳柱純化得到rhBMP-7蛋白，通過BCA法測得rhBM

8、P-7蛋白濃度為28.3mg/L，在緩沖液中可完全溶解。rhBMP-7經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示條帶單一，純度較好。④通過糖苷內切酶(Endo H)酶切rhBMP-7對其進行糖基化分析。未經(jīng)Endo H酶切的rhBMP-7單體rhBMP-7蛋白分子量為34-40KDa，二聚體rhBMP-7蛋白分子量為65-75KDa。經(jīng)Endo H酶切的rhBMP-7單體蛋白分子量為17-20KDa，二聚體rhBMP-7蛋白分子量為34-40KDa。根

9、據(jù)Endo H酶切rhBMP-7的結果得出:U2-OS細胞對表達rhBMP-7蛋白進行了糖基化修飾。⑤rhBMP-7對NIH3T3細胞堿性磷酸酶(ALP)的影響結果顯示:含rhBMP-7培養(yǎng)基使NIH3T3細胞的ALP活性明顯增強，而且呈現(xiàn)出明顯的量、效關系，表明U2-OS細胞表達的rhBMP-7具有生物活性。
　　結論：⑴驗結果表明，可以利用U2-OS細胞表達rhBMP-7，而且信號肽會影響細胞對表達蛋白的分泌效率;hBMP-7