TOM復合體和DNA聚合酶γ的線粒體運輸在早衰邊緣細胞模型中的作用與機制.pdf

1、第一部分建立大鼠耳蝸血管紋邊緣細胞mtDNA4834bp缺失突變早衰模型
　　目的:用大鼠耳蝸血管紋邊緣細胞建立線粒體 DNA4834bp缺失突變早衰模型,為進一步研究mtDNA4834bp缺失突變在年齡相關性聽力損失中的作用機制提供易獲取的研究對象。
　　方法:選取出生3天左右的大鼠,顯微鏡下解剖后分離耳蝸血管紋,消化法接種細胞。經(jīng)多次純化后獲取比較均一的血管紋邊緣細胞,CK-18的免疫熒光化學方法鑒定。細胞經(jīng)不同濃度梯度

2、(0,2,4,6,8,10,12,14,16g/l)的D-半乳糖和D-甘露醇滲透壓組處理3,7天和11天后,采用CCK-8檢測不同濃度D-半乳糖對細胞活力的影響。濃度梯度D-半乳糖處理不同時間(3天和7天)和12g/lD-半乳糖處理細胞不同天數(shù)(1,3,5,7,9,11,13,15天)后,Taqman探針實時定量PCR技術檢測細胞經(jīng)D-半乳糖誘導的濃度和時間依賴性的mtDNA4834bp缺失突變率的累積。細胞經(jīng)12g/lD-半乳糖處理不

3、同天數(shù)(1,5,11天)后,采用β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老的程度。12g/l D-半乳糖處理細胞1天和15天后,行TUNEL原位顯色法檢測邊緣細胞的凋亡狀況。
　　結果:細胞經(jīng)CK-18的免疫熒光染色后,胞漿呈現(xiàn)較強特異性熒光。邊緣細胞經(jīng)濃度梯度D-半乳糖和滲透壓匹配的D-甘露醇處理后,細胞活力變化在D-半乳糖組和滲透壓對照組之間無顯著差異,14g/l和16g/l時細胞活力呈現(xiàn)濃度依賴性下降,以此為依據(jù)選取12g/l作為后續(xù)處

4、理細胞的最佳濃度。D-半乳糖能誘導邊緣細胞出現(xiàn)濃度和時間依賴性的mtDNA4834bp缺失突變的累積,在處理5,7,9,11天時,與對照組相比有顯著差異。β-半乳糖苷酶染色結果顯示,與對照組相比D-半乳糖組藍染細胞呈現(xiàn)時間依賴性的增多,表示細胞的明顯衰老。細胞經(jīng)長時間的D-半乳糖處理后,TUNEL染色結果顯示陽性細胞較對照組明顯增加。
　　結論:成功培養(yǎng)了原代耳蝸血管紋邊緣細胞;D-半乳糖引致的細胞培養(yǎng)環(huán)境滲透壓的變化是導致細胞活

5、力下降的主要原因;D-半乳糖能成功誘導邊緣細胞出現(xiàn)mtDNA4834bp缺失突變,且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性的累積;D-半乳糖能誘導細胞出現(xiàn)早衰的特點;細胞經(jīng)D-半乳糖處理較長時間后才出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。故成功建立了大鼠mtDNA4834bp缺失突變細胞早衰模型。
　　第二部分線粒體外膜轉位酶Tom40的功能狀態(tài)與DNA聚合酶γ的線粒體輸送改變致mtDNA4834bp缺失突變機制的研究
　　目的:探討掌管線粒體前體蛋白輸送的線粒

6、體外膜轉位酶Tom40在mtDNA4834bp缺失突變的累積過程中的功能變化,與線粒體DNA修復酶DNA聚合酶γ的線粒體輸送的關系,以揭示線粒體前體蛋白輸入的功能變化在年齡相關性聽力損失發(fā)病機制中的作用。
　　方法:取正常成年大鼠耳蝸,石蠟包埋后制成石蠟切片,行組織的免疫熒光染色技術檢測Tom40在正常大鼠耳蝸中的表達。原代培養(yǎng)的耳蝸邊緣細胞經(jīng)12g/l D-半乳糖處理11天后,行細胞的免疫熒光化學染色檢測細胞內Tom40的表達情

7、況。邊緣細胞經(jīng)濃度梯度(0,2,4,6,8,10,12g/l)D-半乳糖處理3天和7天后,12g/l D-半乳糖處理不同時間(0,1,3,5,7,9,11天)后納入實驗,分別提取細胞總蛋白以及線粒體蛋白,經(jīng)western blot方法檢測細胞內和線粒體的Tom40,DNA聚合酶γ的表達變化。
　　結果:(1)耳蝸的組織免疫熒光染色結果顯示,Tom40在耳蝸組織中表達豐富,Corti氏器,耳蝸外側壁血管紋以及螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域均有特異性

8、表達。(2)邊緣細胞的免疫熒光結果顯示,細胞含有豐富的線粒體,胞漿和胞核均有Tom40的強表達,且經(jīng)D-半乳糖處理后,胞漿內Tom40的表達減弱。(3)濃度梯度 D-半乳糖誘導細胞內總Tom40的表達先緩慢增加然后降低,且與處理時間無明顯關系。(4)D-半乳糖誘導細胞內Tom40表現(xiàn)出時間依賴性的動態(tài)變化;線粒體的Tom40的表達則明顯增強。(5)細胞內和線粒體的DNA聚合酶γ的表達呈現(xiàn)先增高再減低的趨勢,在mtDNA4834bp缺失突

9、變顯著累積時則表現(xiàn)為明顯下降。
　　結論:Tom40在大鼠內耳血管紋區(qū)域以及原代培養(yǎng)的邊緣細胞中表達豐富,它的功能變化可能會影響到耳蝸細胞的正常功能,而導致疾病的發(fā)生;D-Gal誘導Tom40和DNA聚合酶γ的動態(tài)變化反應了細胞對氧化應激的代償與失代償;細胞內Tom40和DNA聚合酶γ的D-Gal時間累積性變化趨勢吻合,表明Tom40的功能變化影響DNA聚合酶γ的線粒體輸送;細胞內Tom40和DNA聚合酶γ的D-Gal濃度依賴性變

10、化趨勢不一致,尤其是短期誘導后,提示可能有其他因素參與到DNA聚合酶γ的線粒體轉運過程中;線粒體的Tom40在mtDNA4834bp缺失累積的過程中,其功能增強;相反,DNA聚合酶γ的線粒體輸送減少;細胞內和線粒體內Tom40蛋白表達的變化趨勢不一致,提示Tom40蛋白的表達可能受到轉錄后機制的調控。
　　第三部分線粒體外膜轉位酶Tom20和Tom70的功能狀態(tài)與mtDNA4834bp缺失突變機制的研究
　　目的:進一步探討

11、掌管線粒體前體蛋白輸送的線粒體外膜轉位酶的識別受體Tom20和Tom70在mtDNA4834bp缺失突變的累積過程中的功能變化,以揭示在線粒體前體蛋白輸入線粒體內部之前,蛋白的識別功能變化在年齡相關性聽力損失發(fā)病機制中的作用。
　　方法:原代培養(yǎng)的耳蝸邊緣細胞純化后,行細胞的免疫熒光化學染色檢測細胞內Tom20和Tom70的表達情況。邊緣細胞經(jīng)濃度梯度(0,2,4,6,8,10,12g/l)D-半乳糖處理3天和7天后,12g/l

12、D-半乳糖處理不同時間(0,1,3,5,7,9,11天)后納入實驗,分別提取細胞總蛋白以及線粒體蛋白,經(jīng)western blot方法檢測細胞內和線粒體的Tom20和Tom70的表達變化。
　　結果:邊緣細胞的免疫熒光結果顯示,細胞胞漿內含有豐富的Tom70和Tom20,Tom70沿核膜分布明顯;Tom20和Tom70的D-半乳糖濃度依賴性的變化不一致,Tom70經(jīng)低濃度D-半乳糖處理后表達即升至最高,濃度梯度D-Gal誘導的Tom