DNA聚合酶與引物-模板的相互作用對(duì)PCR效率的影響.pdf

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，它的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展對(duì)生物學(xué)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)的意義。PCR反應(yīng)中至關(guān)重要的部分是引物設(shè)計(jì)，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。傳統(tǒng)的PCR引物設(shè)計(jì)方法僅僅考慮了引物的長(zhǎng)度、Tm值和GC含量等因素，而忽略了聚合酶對(duì)不同序列引物/模板DNA的親和性，也即聚合酶與引物/模板的結(jié)合自由能的大小。為了提高PCR引物設(shè)計(jì)的效率，為引物設(shè)計(jì)提供新的更可靠的方法，本文提出了基于能量計(jì)算進(jìn)行

2、引物設(shè)計(jì)的方法。
　　本文為了驗(yàn)證基于能量進(jìn)行引物設(shè)計(jì)方法的可靠性，將該方法應(yīng)用到了實(shí)驗(yàn)室比較容易擴(kuò)增的HSA基因上，結(jié)果表明，基于能量計(jì)算結(jié)果在結(jié)合能較低的位點(diǎn)設(shè)計(jì)的5對(duì)引物的PCR效率（包括PCR產(chǎn)物的量及引物的特異性）普遍高于在結(jié)合能較高的位點(diǎn)設(shè)計(jì)的5對(duì)引物的效率，這說(shuō)明聚合酶與引物/模板DNA的相互作用確實(shí)對(duì)PCR的效率有影響，而且與聚合酶的結(jié)合能較低的引物，其PCR效率普遍偏高。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室比較難擴(kuò)增的PyrF基因，基于能

3、量計(jì)算結(jié)果在結(jié)合能較低的位點(diǎn)設(shè)計(jì)出來(lái)的3對(duì)引物的效率明顯高于普通引物設(shè)計(jì)軟件推薦出的最優(yōu)引物，該結(jié)果印證了上述結(jié)果的可靠性。同時(shí)，本文采用基于結(jié)構(gòu)的分子動(dòng)力學(xué)模擬方法(SBM)對(duì)Taq DNA聚合酶與引物/模板DNA進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬，成功地得到了Taq DNA聚合酶與引物/模板DNA由open狀態(tài)到closed狀態(tài)的反應(yīng)軌跡，有助于我們深入理解聚合酶與引物/模板DNA相互作用的機(jī)制。綜上所述，基于能量計(jì)算結(jié)果進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的方法確實(shí)可