nano-TiO2與PbAc聯(lián)合誘導(dǎo)人胚肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡作用.pdf

1、本文在當(dāng)前單獨PbAc與nano-TiO2的毒理學(xué)作用機(jī)理研究基礎(chǔ)上，探討了二者之間的相互作用及可能的聯(lián)合毒作用機(jī)制，為完善nano-TiO2的毒理學(xué)評價和了解環(huán)境中nano-TiO2與PbAc之間的健康效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。本研究分為四個部分:
　　 第一部分 nano-TiO2的團(tuán)聚效應(yīng)及其對PbAc的吸附作用研究
　　 目的：研究納米二氧化鈦（nano-TiO2）在溶液中的團(tuán)聚作用及TiO2對醋酸鉛（PbAc

2、）的吸附作用。
　　 方法：采用納米粒度儀檢測0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL的nano-TiO2在水溶液中團(tuán)聚后粒度大小；石墨爐原子吸收(Graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS)檢測0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL的nano-TiO2對1 μg/mL的PbAc吸附量的大小。
　　 結(jié)果：各濃度納米二氧化鈦團(tuán)聚后粒度平

3、均大小為298.8 nm,之間并無顯著性差異（P>0.05）；相比較于單一的納米二氧化鈦紅外圖譜，混合物顯示有醋酸基團(tuán)被吸附于納米二氧化鈦；原子吸收結(jié)果顯示0.001、0.01 μg/mL TiO2吸附的PbAc量顯著低于0.1、1、10 μg/mL的 TiO2（P＜0.05）；并且吸附量隨TiO2濃度呈劑量依賴關(guān)系。
　　 結(jié)論：單一nano-TiO2在沒有分散劑的作用下，短時間內(nèi)在水溶液中有團(tuán)聚；對PbAc有明顯吸附作用，并

4、且隨nano-TiO2濃度的升高，吸附量增大。
　　 第二部分 nano-TiO2與PbAc聯(lián)合誘導(dǎo)人胚肝細(xì)胞氧化應(yīng)激作用
　　 目的：觀察nano-TiO2與PbAc單獨及聯(lián)合作用對人胚肝細(xì)胞（L02）活性、活性氧（ROS）含量及氧化應(yīng)激的影響。
　　 方法：0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc，以及0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mLnan

5、o-TiO2和1μg/mLPbAc的混合物聯(lián)合作用于生長良好的L02細(xì)胞，二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，1μL/mL）為陰性對照，將L02細(xì)胞染毒24 hr后，以MTT法檢測nano-TiO2與PbAc單獨及聯(lián)合作用對L02細(xì)胞活性的影響；運用DCFH-DA(2',7'-dichlorofluorescin-diacetate)作為熒光探針，采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測nano-TiO2與PbAc聯(lián)合作用下L0

6、2細(xì)胞內(nèi)ROS含量，同時檢測L02細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）的含量。
　　 結(jié)果：相比陰性對照、PbAc和其他單一TiO2劑量組，10 μg/mL TiO2單獨作用L02細(xì)胞24 hr可顯著降低細(xì)胞活性（P＜0.05）；1μg/mL TiO2相比陰性對照，導(dǎo)致顯著性的細(xì)胞活性降低。與陰性對照相比，0.1、1、10 μg/mL的混合物聯(lián)合作用L02細(xì)胞24 hr可引起細(xì)胞活性顯著性降低（P＜0.05

7、）；與1μg/mL的PbAc單獨作用相比，1、10μg/mL的混合物聯(lián)合作用L02細(xì)胞24 hr可引起細(xì)胞活性顯著性降低（P＜0.05）；所有濃度的nano-TiO2和1 μg/mL的PbAc單獨作用不能引起ROS、SOD、GSH水平的改變（P>0.05）；0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的混合物聯(lián)合作用L02細(xì)胞24 hr可引起ROS顯著性增加（P＜0.05）；單一TiO2和混合物所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、ROS生成顯示出劑量

8、依賴關(guān)系。0.01、0.1、1μg/mL的混合物聯(lián)合作用使細(xì)胞內(nèi)GSH水平較陰性對照組有顯著升高（P＜0.05），并且1μg/mL的混合物聯(lián)合作用使細(xì)胞內(nèi)GSH水平較1μg/mL的PbAc單獨作用有顯著升高（P＜0.05）；與陰性對照相比，0.01、0.1μg/mL的混合物聯(lián)合作用使細(xì)胞中抗氧化酶SOD活力顯著性升高（P＜0.05）；單一TiO2所誘導(dǎo)的GSH和SOD水平顯示出劑量依賴關(guān)系。析因分析結(jié)果顯示兩種受試物混和染毒對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞

9、活性、ROS、GSH、SOD水平不存在交互協(xié)同作用（P>0.05）。
　　 結(jié)論：證明在低濃度無紫外的條件下，nano-TiO2和PbAc聯(lián)合作用可增強(qiáng)細(xì)胞毒性、促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生和抗氧化物質(zhì)應(yīng)激性升高；nano-TiO2和PbAc聯(lián)合作用可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，低濃度混合物作用時，上升的氧化應(yīng)激觸發(fā)了細(xì)胞保護(hù)防御的正調(diào)節(jié)作用，使細(xì)胞還擁有一定的抗氧化能力從而阻礙進(jìn)一步的氧化損傷；而高濃度時，則觸發(fā)了負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而導(dǎo)致抗氧化能力下降

10、。
　　 第三部分 nano-TiO2與PbAc聯(lián)合誘導(dǎo)人胚肝細(xì)胞DNA損傷及其對修復(fù)蛋白的影響研究
　　 目的：研究nano-TiO2與PbAc單獨及聯(lián)合作用對L02細(xì)胞活性、DNA損傷以及對OGG1(8-oxoguanine DNA glycosylase homolog 1)修復(fù)蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc，以及

11、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的混合物聯(lián)合作用于生長良好的L02細(xì)胞，DMSO（1 mL/L）為陰性對照，L02細(xì)胞處理時間為24 hr；運用堿性彗星試驗和DNA氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG(8-Hydroxydeoxyguanosine)的含量檢測各組DNA斷裂損傷程度；運用western blot檢測單獨及聯(lián)合作用對細(xì)胞DNA修復(fù)蛋白OGG1的影響。
　　 結(jié)果：相比陰性對照、1μg/mL PbAc，10μg

12、/mL混合物作用L02細(xì)胞24 hr可導(dǎo)致顯著性升高的Olive尾距(Olive tail moment，OTM)（P＜0.05）；相比陰性對照，1μg/mL混合物作用導(dǎo)致顯著性升高的OTM（P＜0.05）。所有濃度的nano-TiO2和1 μg/mL的PbAc單獨作用不能引起8-OHdG的含量和細(xì)胞DNA修復(fù)蛋白OGG1表達(dá)相對于陰性對照的顯著性改變（P>0.05）；1、10μg/mL的混合物聯(lián)合作用L02細(xì)胞導(dǎo)致8-OHdG的含量顯

13、著高于陰性對照組（P＜0.05）；10μg/mL混合物聯(lián)合作用導(dǎo)致8-OHdG的含量顯著高于PbAc單獨作用（P＜0.05）。0.001、0.01、0.1、1μg/mL的混合物聯(lián)合作用使細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)蛋白OGG1表達(dá)水平較陰性對照組和PbAc單獨作用有顯著升高（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：nano-TiO2和PbAc聯(lián)合作用可增強(qiáng)L02細(xì)胞DNA損傷，同時協(xié)同增強(qiáng)調(diào)節(jié)DNA修復(fù)蛋白OGG1修復(fù)損傷的DNA，細(xì)胞還擁有一定的修

14、復(fù)損傷DNA的能力。
　　 第四部分nano-TiO2與PbAc聯(lián)合誘導(dǎo)人胚肝細(xì)胞凋亡效應(yīng)研究：
　　 目的：研究nano-TiO2與PbAc單獨及聯(lián)合作用對L02凋亡效應(yīng)及對凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3(Cysteine-asparate protease 3)表達(dá)的影響。
　　 方法：0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc，以及0.001、0.01、0.1

15、、1、10μg/mL的混合物聯(lián)合作用于生長良好的L02細(xì)胞，DMSO(1 mL/L)為陰性對照，L02細(xì)胞處理時間為24 hr。
　　 結(jié)果：單一1μg/mL的PbAc單獨作用不能引起細(xì)胞早期凋亡水平相對于陰性對照的顯著性改變(P>0.05）；1、10 μg/mL的nano-TiO2導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡水平顯著高于DMSO、PbAc以及0.001、0.01和0.1 μg/mL nano-TiO2單獨作用(P＜0.05）；0.1μg/

16、mL的nano-TiO2導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡水平顯著高于DMSO、PbAc、0.001、0.01 μg/mL nano-TiO2單獨作用（P＜0.05）；而所有的混合物均導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡水平顯著高于DMSO陰性對照和PbAc單獨作用(P＜0.05）。所有濃度的nano-TiO2和1μg/mL的PbAc單獨作用不能引起細(xì)胞晚期凋亡水平相對于陰性對照的顯著性改變（P>0.05）。
　　 結(jié)論：nano-TiO2和PbAc聯(lián)合作用可增強(qiáng)誘