PKCβ-p66Shc氧化應(yīng)激通路對(duì)高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡的作用.pdf

1、目的：探討PKCβ/p66Shc氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞凋亡的作用,探討PKCβ抑制劑LY333531對(duì)高氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)是將體外傳代培養(yǎng)的人肺泡Ⅱ型上皮A549細(xì)胞系(A549細(xì)胞)作為研究對(duì)象。以高體積分?jǐn)?shù)氧(高氧)誘導(dǎo)人A549細(xì)胞模型為基礎(chǔ),以3L/min的速度通入含有95％氧氣的高純混合氣處理細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞A549隨機(jī)分為三組:對(duì)照組、高氧組,LY333531組

2、。對(duì)照組:加入含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng);高氧組:加入等量的上述培養(yǎng)液,換液后,通入3L/min的90%氧氣和5%二氧化碳高純混合氣10min,在培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng);LY333531組:用終濃度為10μmol/L的等量PKCβ特異性抑制劑LY333531的培養(yǎng)液預(yù)處理A549細(xì)胞24h后,再用高氧誘導(dǎo)A549細(xì)胞,10分鐘后密閉培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞檢測(cè)以下指標(biāo):倒置相差顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)

3、學(xué)改變并照相;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高氧及LY333531對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響;采用SP細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)分組24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表達(dá);WesternBlot檢測(cè)24h后PKCβ/Pin1/P66Shc/P66Shc-Ser36蛋白的表達(dá);激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)分組24小時(shí)后P66Shc在線粒體內(nèi)的轉(zhuǎn)位;激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)分組24小時(shí)后線粒體活性氧簇產(chǎn)生的情況;激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)分組

4、24小時(shí)后線粒體膜電位的變化。
　　結(jié)果：(1)倒置顯微鏡下,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,呈扁圓多角形,數(shù)量多,排列緊密,連接成片,懸浮細(xì)胞較少。高氧組生長(zhǎng)狀態(tài)較差,細(xì)胞形態(tài)由典型的扁圓多角形細(xì)胞變成圓形或橢圓形,間隙增加,連接松散,活細(xì)胞數(shù)量明顯降低,懸浮細(xì)胞數(shù)量明顯增多。LY3333531組生長(zhǎng)狀態(tài)欠佳,活細(xì)胞數(shù)量較高氧組增多,懸浮細(xì)胞數(shù)較高氧組減少,但是未達(dá)到對(duì)照組的水平;(2)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:高氧組與對(duì)照組相比,細(xì)胞凋亡率明顯增

5、加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而LY3333531組的凋亡率有所降低,與高氧組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);(3)免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,高氧組24h后A549細(xì)胞內(nèi)PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表達(dá)均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高氧組相比,LY3333531組Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(4)

6、western-blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,高氧組24小時(shí)后A549細(xì)胞內(nèi)PKCβ/Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36蛋白表達(dá)均明顯著增加,差異有顯著性(P<0.05)。與高氧組相比,LY3333531組Pin1/p66Shc/p66Shc-Ser36的表達(dá)明顯降低,差異有顯著性(P<0.05)。(5)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,高氧組細(xì)胞p66Shc蛋白的轉(zhuǎn)位率明顯增加,差異有顯著性(P<0.05),與高

7、氧組相比,LY3333531組轉(zhuǎn)位率明顯降低,差異有顯著性(P<0.05)。(6)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:線粒體ROS呈紅色熒光,細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。正常對(duì)照組紅色熒光僅有微弱表達(dá);與對(duì)照組相比,高氧組細(xì)胞紅色熒光含量顯著增加,差異有顯著性(P<0.05);LY333531組
　　紅色熒光含量較高氧組有所減少,差異有顯著性(P<0.05),但未減少至對(duì)照組水平(P<0.05)。(7)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,高氧組線

8、粒體膜電位△Ψm明顯下降,差異有顯著性(P<0.05);與高氧組相比,LY333531組線粒體膜電位升高,差異有顯著性(P<0.05),但未達(dá)到對(duì)照組水平(P<0.05)。
　　結(jié)論：高氧能誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的損傷,能導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。其具體的機(jī)制為高氧氣能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)PKCβ表達(dá)增多,進(jìn)而Pin1、p66Shc表達(dá)增多,發(fā)生磷酸化,然后轉(zhuǎn)位于線粒體,線粒體ROS產(chǎn)生增多,線粒體膜電位△Ψm下降。相反,PKCβ抑制劑LY333531能