丹參酮ⅡA對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用.pdf

1、本課題分兩部分進(jìn)行。第一部分體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在過氧化氫誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)上，觀察丹參酮ⅡA預(yù)處理后對心肌細(xì)胞是否有保護(hù)作用。第二部分采用大鼠心肌缺血再灌注作為體內(nèi)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌凋亡模型，觀察在手術(shù)前兩周給予丹參酮ⅡA是否有抑制凋亡的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。 一丹參酮ⅡA對過氧化氫誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 研究目的：建立過氧化氫誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型，在此基礎(chǔ)上研究丹參酮ⅡA對心肌細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作

2、用。 研究方法：采用本室建立的改良法培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，并建立過氧化氫損傷乳鼠心肌細(xì)胞模型，以細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、DNA亞二倍體峰面積、DNAladder為指標(biāo)評價(jià)過氧化氫對心肌細(xì)胞的損傷狀況，并觀察給予丹參酮ⅡA預(yù)處理2小時(shí)后上述心肌損傷指標(biāo)的變化。 結(jié)果：1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.2mM-0.8mM過氧化氫對乳鼠心肌細(xì)胞的損傷呈濃度依賴性，其中0.2mM，0.4mM過氧化氫對細(xì)胞的損傷呈時(shí)間依賴性，給予10-5、

3、10-6丹參酮ⅡA預(yù)處理2小時(shí)可劑量依賴性地抑制0.2mM，0.4mM過氧化氫對心肌細(xì)胞的損傷。 2.從DNA凝膠電泳結(jié)果可看出，0.1，0.2，0.4mM過氧化氫可劑量依賴性地誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，10-5M，10-6M丹參酮ⅡA能減少DNAladder的形成，抑制凋亡的發(fā)生。其中10-5M丹參酮ⅡA的作用強(qiáng)于10-6M丹參酮ⅡA。 3.通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，Hochest33342核染色改變以及DNA亞二倍體凋亡峰面積

4、變化進(jìn)一步驗(yàn)證，10-5M丹參酮ⅡA能夠部分抑制0.4mM過氧化氫導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷和凋亡發(fā)生。 結(jié)論：1.利用本室建立的乳鼠心肌細(xì)胞改良法成功分離和培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上成功地以過氧化氫為刺激因素體外模擬氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷模型； 2.丹參酮ⅡA對過氧化氫導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。 二丹-參酮ⅡA對大鼠心肌缺血再灌注誘導(dǎo)心肌凋亡的影響 研究目的：為了進(jìn)一步確定丹參酮ⅡA的抗凋亡作用，

5、本部分研究在大鼠冠狀動脈左前降支缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)上觀察丹參酮ⅡA對心肌損傷和凋亡的影響及其可能的機(jī)制。 研究方法：1.將大鼠分為五組，分別為假手術(shù)組、缺血再灌注模型組、丹參酮ⅡA高劑量組+缺血再灌注組、丹參酮ⅡA中劑量組+缺血再灌注組、丹參酮ⅡA低劑量+缺血再灌注組。手術(shù)前兩周，假手術(shù)組和缺血再灌注組每天按10ml/kg灌胃給予0.5％CMC-Na，丹參酮ⅡA高中低劑量分別按60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg劑量

6、灌胃給藥。 2.檢測Caspase-3裂解活性亞型P17蛋白的表達(dá)，建立心肌缺血再灌注誘導(dǎo)凋亡模型的實(shí)驗(yàn)方案。 3.通過組織HE染色觀察缺血再灌注后心臟組織病理改變以及丹參酮Ⅱ?qū)ζ涞挠绊?。采用TUNEL檢測斷裂DNA以及westernblot檢測Caspase-3P17活性蛋白表達(dá)的方法觀察丹參酮ⅡA是否具有抑制心肌凋亡的作用。 4.采用檢測血清SOD活性以及MDA水平的方法，探討丹參酮ⅡA抗心肌凋亡作用是否和其

7、抗氧化作用有關(guān)。 5.采用westernblot方法檢測各組大鼠心臟組織Bcl-2、Bax的表達(dá)，探討丹參酮ⅡA抗心肌凋亡作用是否和Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)改變有關(guān)。 結(jié)果：1.大鼠冠狀動脈左前降支缺血45分鐘再灌注120分鐘可使心肌組織Caspase-3蛋白裂解成17KD的活性亞型。 2.高劑量和中劑量丹參酮ⅡA可明顯改善缺血再灌注心肌組織病理改變。 3.高劑量和中劑量丹參酮ⅡA可將缺血再灌注組TUN

8、EL陽性細(xì)胞率由19.37％分別降至5.33％和8％。低劑量丹參酮ⅡA心肌TUNEL陽性率和缺血再灌注組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三個(gè)劑量丹參酮ⅡA均未能使心肌Caspase-3裂解成17KD的活性亞型。 4.高劑量和中劑量丹參酮ⅡA可提高血清SOD活性和降低MDA水平，和缺血再灌注組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外它們還可以上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。低劑量丹參酮ⅡA上述指標(biāo)的改變和缺血再灌注組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax蛋白表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)