泛素連接酶Cbl-b對(duì)皮膚黑素瘤增殖、凋亡、侵襲能力的影響及其作用機(jī)制初步研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
　　第一部分 泛素連接酶Cbl-b在皮膚黑素瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及意義
　　目的:探討泛素連接酶Cbl-b在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14、MV3和黑素瘤組織中表達(dá)情況，并分析其與黑素瘤臨床病理特征的相關(guān)性。
　　方法:通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Cbl-b蛋白在69例皮膚黑素瘤組織及30例色素痣表達(dá)，并分析其與皮膚黑素瘤臨床病理特征相關(guān)性。QPCR、細(xì)胞免疫熒光、Westernblot檢

2、測(cè)Cbl-b在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14、MV3及黑素細(xì)胞中mRNA及蛋白水平。
　　結(jié)果:免疫組化發(fā)現(xiàn)Cbl-b在69例皮膚黑素瘤和30例色素痣中分別有52例(75.36％)和4例陽(yáng)性(13.33％)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=32.745，p＜0.01)。Cbl-b表達(dá)與皮膚黑素瘤相關(guān)預(yù)后因素，如腫瘤進(jìn)展、Clark分級(jí)和Breslow厚度呈顯著正相關(guān)(rs=0.569; rs=0.654;rs=0.727，p值均＜0.0

3、1)。潰瘍組Cbl-b表達(dá)顯著高于非潰瘍組(p＜0.01)。QPCR示Cbl-b在黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞株A375、M14、MV3 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=176.537，p＜0.01)。細(xì)胞免疫熒光、免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)皮膚黑素瘤細(xì)胞株Cbl-b表達(dá)均高于正常黑素細(xì)胞，以A375表達(dá)水平最高。
　　結(jié)論:皮膚黑素瘤和其細(xì)胞株均高表達(dá)Cbl-b蛋白，說(shuō)明Cbl-b可能在皮膚黑素瘤發(fā)病過(guò)程中起正性調(diào)控作用。
　　第二部分

4、 泛素連接酶Cbl-b基因shRNA慢病毒載體構(gòu)建及其對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞生物學(xué)行為影響
　　目的:構(gòu)建泛素連接酶Cbl-b基因shRNA慢病毒載體，并研究其對(duì)黑素瘤A375細(xì)胞生物學(xué)行為影響。
　　方法:設(shè)計(jì)并合成3條沉默Cbl-b基因的特異性shRNA，構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染黑素瘤A375細(xì)胞。應(yīng)用QPCR和Western blot篩選沉默效率最高重組慢病毒載體。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期，

5、Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建3條Cbl-b shRNA慢病毒載體。QPCR和Western blot發(fā)現(xiàn)CBLB-shRNA-3沉默效率最高。CCK8檢測(cè)表明CBLB-shRNA-3組細(xì)胞增殖能力在72h和96h較陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組明顯減低(p＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示CBLB-shRNA-3組凋亡率(22.73±6.58)％明顯高于陰性對(duì)照組(6.08±1.35)％和空白對(duì)照組(6.34±1

6、.07)％(p＜0.01)。CBLB-shRNA-3組G1期細(xì)胞比例明顯高于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(p＜0.01)，而S期細(xì)胞比例明顯低于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組(p＜0.01)，表明細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯。Transwell檢測(cè)結(jié)果示陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組和CBLB-shRNA-3組72h時(shí)穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(76.60±1.82)個(gè)，(73.20±3.83)個(gè)，(19.60±1.14)個(gè)，CBLB-shRNA-3組明顯低于陰性對(duì)照組、空白

7、對(duì)照組(p＜0.01)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建高效沉默Cbl-b基因的CBLB-shRNA-3 shRNA重組慢病毒載體，沉默Cbl-b可抑制黑素瘤A375細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　第三部分 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)分析Cbl-b在黑素瘤細(xì)胞A375中相關(guān)蛋白
　　目的:分析Cbl-b在黑素瘤細(xì)胞A375中相關(guān)蛋白。
　　方法:使用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定Cbl-b shRNA組A375細(xì)胞株及陰

8、性對(duì)照A375細(xì)胞株差異蛋白表達(dá)。采用生物信息學(xué)方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析。利用Western blot驗(yàn)證部分差異蛋白(EphA2、GSK3β)表達(dá)和Cbl-b shRNA干擾后p-AKT表達(dá)。
　　結(jié)果:本次試驗(yàn)共鑒定3449種蛋白，其中差異表達(dá)蛋白質(zhì)74個(gè)，Cbl-b shRNA組相對(duì)陰性對(duì)照組上調(diào)蛋白52個(gè)，下調(diào)蛋白22個(gè)。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白可有效區(qū)分樣本。GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要生物學(xué)過(guò)程包括:整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附、單

9、一生物代謝過(guò)程、整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)靶向線粒體、核苷酸代謝進(jìn)程;主要分子功能包括:DNA結(jié)合、2，2鐵硫簇合物結(jié)合、信號(hào)受體活性、鈣粘蛋白結(jié)合。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)通路主要包括:葉酸生物合成、軸突導(dǎo)向、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏合連接、Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、葉酸拮抗劑抵抗、氧化磷酸化、PI3K-Akt信號(hào)通路等。Western blot驗(yàn)證差異蛋白EphA2、GSK3β表達(dá)與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。Cbl-