五株海洋來源放線菌次級代謝產(chǎn)物及其活性研究.pdf

1、由于其自身特殊的生存環(huán)境，海洋來源放線菌具有復(fù)雜獨(dú)特的代謝途徑，產(chǎn)生了許多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性良好的次級代謝產(chǎn)物，這些活性代謝產(chǎn)物為新藥的開發(fā)提供了豐富的先導(dǎo)化合物，有些已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究。為開發(fā)海洋來源放線菌資源，探尋新結(jié)構(gòu)的生物活性化合物，本文選取了海洋生境來源的五株放線菌作為目標(biāo)菌株，進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究。研究的主要內(nèi)容包括以下幾部分：1）海洋來源放線菌分離方法的摸索與菌株的分離；2）菌株的化學(xué)篩選、活性篩選與分

2、子探針篩選；3）次級代謝產(chǎn)物的分離純化；4）單體化合物平面結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)的確定；5）單體化合物生物活性的初步評價(jià)。
　　綜合運(yùn)用海洋放線菌分離在樣品預(yù)處理，選擇性培養(yǎng)基配制，抑制劑選擇方面的部分方法，從十二個(gè)海洋來源的樣品中分離得到放線菌136株。對實(shí)驗(yàn)室288株海洋來源的放線菌進(jìn)行了化學(xué)篩選，經(jīng)過初步排重與再排重得到103株放線菌，豐富了實(shí)驗(yàn)室的放線菌TLC和HPLC指紋圖譜庫。對103株放線菌進(jìn)行了P388腫瘤細(xì)胞的活性篩選，

3、得到抗腫瘤活性菌株25株，為海洋抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物的研究提供了活性菌株資源。設(shè)計(jì)了基于PKS、NRPS、PT和鹵代酶等功能基因的特異性引物對菌株進(jìn)行基因篩選，結(jié)合活性和化學(xué)篩選，選取了一株分子探針篩選呈陽性、具有抗腫瘤活性和豐富 TLC薄層行為和HPLC圖譜特征的放線菌CHQ-64為本文的重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)菌株。本論文另外4株實(shí)驗(yàn)菌株，包括3株海泥或海綿來源的高活性抗腫瘤菌株，以及1株海綿來源的具有豐富的TLC薄層行為和特殊的HPLC圖譜特征的

4、菌株。
　　對目標(biāo)菌株發(fā)酵產(chǎn)物通過各種常規(guī)柱色譜及高效液相色譜等化學(xué)分離純化手段，從中國南海紅樹林海泥來源放線菌CHQ-64的放線菌2號培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)提取物中分離得到42個(gè)化合物(1-42)，從其放線菌2號培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)提取物中分離得到7個(gè)化合物(43-49)；從廣東硇洲島海綿樣品來源放線菌CMN-62的代謝產(chǎn)物中分離得到7個(gè)化合物(50-56)；從西沙海綿樣品來源放線菌CMN-1的代謝產(chǎn)物中分離得到8個(gè)化合物(57-64)；從膠

5、州灣海泥樣品來源放線菌CHQ-2的代謝產(chǎn)物中分離得到3個(gè)化合物(65-67)；從膠州灣海泥樣品來源放線菌CHQ-25的代謝產(chǎn)物中分離得到3個(gè)化合物(68-70)，共70個(gè)化合物。
　　利用理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法(MS, IR, UV, CD, NMR, CD量子計(jì)算 and X-ray)闡明了70個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(Fig.1)?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)類型包括吲哚萜類化合物7個(gè)(1-6,43)，多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物6個(gè)(7-12)，生物堿類化

6、合物28個(gè){包括吡咯類化合物6個(gè)(13-18)，殺粉蝶菌素類化合物5個(gè)(43-47)，吲哚咔唑類化合物3個(gè)(68-70)，其它生物堿類化合物14個(gè)(25-32,37,39-41,55-56)}，聚酮長鏈類化合物2個(gè)(48-49)，環(huán)二肽類化合物9個(gè)(19-24,60-62)，苯衍生物5個(gè)(33-36,54)，氨基糖苷類衍生物4個(gè)(50-53)，γ-丁內(nèi)酯衍生物3個(gè)(57-59)，放線菌素類化合物3個(gè)(65-67)和其它類化合物3個(gè)(38

7、,63-64)。其中發(fā)現(xiàn)新化合物23個(gè)，包括2個(gè)具有罕見稠環(huán)形式的吲哚萜類化合物(1-2)，4個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的drimentine類化合物(3-5,43)，6個(gè)多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物(7-12)，3個(gè)生物堿類化合物(14-15,40)，2個(gè)苯衍生物(35-36)，2個(gè)聚酮長鏈類化合物(48-49)，4個(gè)氨基糖苷類衍生物(50-53)。采用NOESY、X-Ray、CD以及CD量子計(jì)算等方法確定了吲哚萜類化合物(1-5)的相對及絕對構(gòu)型；采用生合

8、成關(guān)系、偶合常數(shù)對比、Mosher反應(yīng)等方法確定了多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物(7-12)和氨基糖苷類衍生物(50-53)的相對及絕對構(gòu)型。
　　在活性方面，對于新骨架indotertine類化合物，含醛基的化合物2顯示了對 HCT-8和A-549兩種腫瘤細(xì)胞的抑制活性，IC50分別是6.96和4.88μM;屬于drimentine類化合物的新化合物4，顯示了對HCT-8，Bel-7402，A549和A2780四種腫瘤細(xì)胞的抑制活性, I

9、C50分別是2.81，1.38，1.01和2.54μM，顯示了很好的抗腫瘤活性，已經(jīng)申請專利。采用96孔板的方法，以制霉菌素為陽性藥，評測了6個(gè)多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物對白色念珠菌的抑制活性，其中化合物7有較強(qiáng)的抗Candida albicans活性，MICs是25-50μM，與陽性藥制霉菌素相當(dāng)。CMN-1中分離得到的3個(gè)γ-丁內(nèi)酯衍生物(57-59)均顯示具有群體感應(yīng)活性，其中化合物59有較強(qiáng)的群體感應(yīng)活性。部分化合物的生物活性評價(jià)仍在

10、進(jìn)行中。
　　綜上所述，本文共闡明了5株海洋來源放線菌中70個(gè)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，其中包括新化合物23個(gè)。在新化合物的研究中，本文首次發(fā)現(xiàn)由色氨酸和倍半萜雜合途徑生成的五元環(huán)駢合形式的吲哚倍半萜類化合物(1-2)；從天然界得到具有呋喃環(huán)的結(jié)構(gòu)新穎的多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物(12)；從微生物中得到的罕見的氨基糖苷類衍生物(53)。在活性研究中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)抗腫瘤活性較強(qiáng)的新化合物(2,4)；1個(gè)抗真菌活性較強(qiáng)的新化合物(7)；首次發(fā)現(xiàn)已知化合

11、物59具有顯著的群體感應(yīng)活性。上述研究為海洋天然產(chǎn)物化學(xué)提供了結(jié)構(gòu)新穎的化合物骨架，為抗腫瘤、抗菌等生物活性研究提供了活性化合物模板。本文的重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)菌株CHQ-64，PKS I和NRPS分子探針篩選呈陽性、具有抗腫瘤活性和豐富TLC薄層行為和HPLC圖譜特征，從中分離得到49個(gè)化合物，新化合物19個(gè)，涵蓋多種化合物結(jié)構(gòu)類型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基因-活性-化學(xué)集成篩選的方法，可以在一定程度上能夠克服放線菌株重復(fù)研究和單純以生物活性為導(dǎo)向的天然