雞傳染性支氣管炎病毒廣西分離株的致病性研究及實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。IBV基因組十分容易發(fā)生變異，導致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等發(fā)生變異，給本病的防控帶來很大的困難。
　　 近年來對IBV的分型研究很多，但對致病性沒有做進一步的研究，更沒有研究致病性和基因組

2、變異之間的關系。結合IBV基因變異的情況，研究其在感染組織中的動態(tài)分布情況、消長規(guī)律和組織親嗜性變化，揭示IBV分子變異機理，是目前冠狀病毒研究的熱點。近年來第3群禽冠狀病毒的宿主范圍有擴大的趨勢，除雞、火雞外，野鴿和家鴿等均可感染，但目前缺乏雞源冠狀病毒對鴿的致病性研究。目前檢測IBV的方法眾多，但存在無法定量的缺陷，病毒的定量檢測對致病機理、免疫機理、防控效果的研究都具有重要意義。針對這些問題，本研究進行了IBV的致病性試驗以及建立

3、IBV的實時熒光定量RT-PCR檢測方法。
　　 首先，在本課題組對26個廣西IBV分離株進行基因分型將其分為4個基因型的基礎上，從中選擇代表4個不同基因型的9個廣西IBV分離株進行人工感染雛雞的試驗。結果表明，4個基因型的廣西流行毒株對非免疫雛雞均具有致病能力，潛伏期為24h至48h，發(fā)病率88.8％至100％；基因型I（與H120親緣關系很遠）的GX-YL5、GX-C、GX-YL9、GX-NN1和GX-NN6能引起試驗雞死亡

4、，死亡率可達11.1％-44.4％，并引起呼吸系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的病變；試驗雞可帶毒和通過泄殖腔排毒42天。而與H120親緣關系很近或與4/91親緣關系很近的廣西分離株未能引起試驗雞死亡。
　　 第二，應用本課題組建立的套式RT-PCR對人工感染GX-YL5分離株的雛雞不同臟器中的病毒進行跟蹤監(jiān)測和組織病理學觀察。結果表明肝臟和肺帶毒19天，胸腺和腺胃帶毒21天，盲腸扁桃體和氣管連續(xù)帶毒26天，腎臟帶毒長達40天，感染雞帶毒和排毒持

5、續(xù)時間可達42天；病毒能引起氣管分泌粘液、氣管和細支氣管纖毛脫落、炎癥細胞浸潤，肺充血、淋巴細胞浸潤，導致腎臟發(fā)生間質(zhì)性腎炎以及法氏囊水腫。結果顯示該毒株不但致病力強，排毒時間長，而且具有廣泛的組織嗜性，能引起多個器官組織細胞結構發(fā)生變化。
　　 第三，選擇對雞致死率最高的分離株GX-YL5及與鴿源冠狀病毒S1基因高變區(qū)同源性很高的分離株GX-YL2對鴿子進行攻毒，結果顯示GX-YL2和GX-YL5分別引起50％和25％鴿子出現(xiàn)

6、呼吸道癥狀，并可以在鴿子體內(nèi)迸行增殖，帶毒28天，但通過泄殖腔排毒不明顯：鴿子感染IBV的解剖病變包括氣管分泌粘液，肺出血，胰臟出現(xiàn)水腫及炎癥，組織切片觀察見到胰腺中性粒細胞浸潤、水腫，氣管上皮細胞腫脹，肺出血等。整個實驗過程未見到致鴿子死亡。表明了對雞具有較強致病能力的雞源IBV可以感染肉鴿，能在肉鴿體內(nèi)不同組織中增殖，對肉鴿有一定的致病力，但對鴿子致病力不強。
　　 第四，為了更好地研究IBV的病毒載荷量與致病機理、免疫機理

7、、防控效果的關系，本課題建立了靈敏度高、特異性強、可重復性好的SYBRGreen I實時熒光定量RT-PCR檢測方法，該方法最小可以準確檢測到10拷貝/μL的目的基因，常見禽類病毒NDV、IBDV、ARV和ILTV均不能擴增。為本課題下一步的免疫原性試驗提供很好的技術工具。
　　 綜上所述，本課題研究結果表明，與H120親緣關系很遠的廣西IBV分離株對易感雛雞有較強的致病能力，但對鴿子致病力比較弱；建立的實時熒光定量RT-PCR