虎杖及其培養(yǎng)物中芪類和蒽醌類化合物分析檢測(cè)方法的研究.pdf

1、虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）為多年生蓼科草本植物，在我國廣泛分布于秦嶺以南地區(qū)，根或根莖入藥，為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥常用中藥材?；⒄戎兄饕熊晤?、蒽醌類、黃酮類及酚類等成分，其中芪類主要成分為白藜蘆醇和虎杖苷，蒽醌類成分主要包括大黃素和大黃素甲醚等。由于受地理因素和生長(zhǎng)環(huán)境的影響，不同產(chǎn)區(qū)的虎杖的化學(xué)組成不盡相同。中藥化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性是其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，而目前虎杖的質(zhì)量控制主要是針

2、對(duì)單一種類的有效物質(zhì)，如大黃素，因此不能全面反映藥材的質(zhì)量。建立可以同時(shí)檢測(cè)虎杖中主要成分芪類和蒽醌類的色譜方法可以更好的控制虎杖藥材的質(zhì)量。隨著對(duì)虎杖藥理學(xué)研究的深入，其有效成分白藜蘆醇和虎杖苷的生物活性作用被不斷認(rèn)識(shí)，因此需求量越來越大。為了有效地保護(hù)虎杖野生資源，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)解決虎杖資源的問題越來越受到人們的重視，并已有文獻(xiàn)報(bào)道。由于組織培養(yǎng)條件的多變，試驗(yàn)量較大，因此培養(yǎng)條件的快速篩選顯得非常重要。又由于試驗(yàn)過程中目標(biāo)物

3、的含量有時(shí)較低，因此建立靈敏、準(zhǔn)確和快速簡(jiǎn)便的適用于培養(yǎng)物含量監(jiān)測(cè)的分析方法十分必要。本文建立的聚酰胺薄膜薄層色譜，熒光檢測(cè)和液-質(zhì)聯(lián)用方法由于具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確性強(qiáng)、易于操作，更適用于培養(yǎng)物的分析。
　　 藥用中藥指紋圖譜是運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)中藥化學(xué)信息以圖形的方式進(jìn)行表征并加以描述的中藥質(zhì)量分析的一種新方法。它通過反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，提供全面的、綜合的信息以控制中藥材的質(zhì)量。因此，建立虎杖藥材的指紋圖譜對(duì)進(jìn)

4、一步控制虎杖藥材的質(zhì)量是十分必要的，同時(shí)采用指紋圖譜技術(shù)也可對(duì)虎杖培養(yǎng)物與虎杖生藥進(jìn)行較全面的對(duì)比。
　　 目的：采用薄層色譜法和高效液相色譜法建立虎杖生藥中主要有效成分芪類（白藜蘆醇和虎杖苷）和蒽醌類（大黃素和大黃素甲醚）的定性和定量的方法。建立虎杖的HPLC指紋圖譜，得到對(duì)照?qǐng)D譜，為科學(xué)評(píng)價(jià)與有效控制虎杖藥材質(zhì)量提供新方法。利用建立的薄層色譜法和高效液相色譜法篩選出白藜蘆醇或虎杖苷含量較高的虎杖培養(yǎng)物，為虎杖培養(yǎng)物的擴(kuò)大培養(yǎng)

5、和進(jìn)一步的研究提供材料。
　　 方法：
　　 1.生藥虎杖薄層色譜鑒別研究:（1）大黃素、白藜蘆醇和虎杖苷的鑒別：以微乳液為展開劑，聚酰胺薄膜為固定相，并配以一定比例的甲酸、丙酮為有機(jī)改性劑，熒光檢測(cè)，建立較為適宜的分離鑒別虎杖中大黃素、白藜蘆醇和虎杖苷的薄層分離條件。（2）白藜蘆醇和虎杖苷的順、反異構(gòu)體鑒別：以微乳液為展開劑，聚酰胺薄膜為固定相，并配以一定比例的甲酸、甲醇為有機(jī)改性劑，熒光檢測(cè)，建立較為適宜的分離鑒別虎

6、杖中白藜蘆醇和虎杖苷的順、反異構(gòu)體鑒別的薄層分離條件。（3）蒽醌類成分的鑒別：以石油醚-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，硅膠G為固定相，熒光檢測(cè)，建立同時(shí)分離鑒別虎杖中5種蒽醌類成分的薄層分離條件。
　　 2.虎杖HPLC指紋圖譜研究:（1）比較不同提取方法、不同提取溶劑及不同提取時(shí)間的提取效果，選擇提取成分較多，提取效率較高的提取條件。（2）選用合適的色譜柱及檢測(cè)波長(zhǎng)，調(diào)整流動(dòng)相的組成和配比，使色譜圖符合指紋圖譜研究的要求。（3）在已

7、確定的色譜條件下，考察指紋圖譜中虎杖苷的分離度和理論塔板數(shù)。（4）對(duì)方法的精密度、重復(fù)性和樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。（5）按選定的方法制備溶液，在已確定的色譜條件下得到虎杖對(duì)照指紋圖譜，并與不同產(chǎn)地虎杖藥材指紋特征相比較。
　　 3.RP-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的含量在不影響虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的分離條件下，調(diào)整指紋圖譜流動(dòng)相的比例，縮短分析時(shí)間，測(cè)定10個(gè)不同產(chǎn)地虎杖中4種

8、主要成分的含量。
　　 4.虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷順反異構(gòu)體液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法的研究采用反相高效液相色譜法，以乙腈和0.1％甲酸為流動(dòng)相梯度洗脫，多離子選擇檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)。初步建立同時(shí)檢測(cè)虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷順、反異構(gòu)體的HPLC-MS分析方法。
　　 5.虎杖培養(yǎng)物的分析測(cè)定采用本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)建立的薄層色譜法和高效液相色譜法篩選出培養(yǎng)周期短，且白藜蘆醇或虎杖苷含量高的虎杖培養(yǎng)株系，為虎杖培養(yǎng)物的擴(kuò)大培養(yǎng)及進(jìn)一步

9、的研究提供材料。
　　 結(jié)果：
　　 1.生藥虎杖薄層色譜鑒別研究:（1）大黃素、白藜蘆醇和虎杖苷的鑒別：以含水量80％的微乳液-甲酸-丙酮（1.0：1.0：0.5）為適宜的展開劑。與普通展開劑相比，該展開劑分離效果顯著提高，且斑點(diǎn)集中，靈敏度提高。（2）白藜蘆醇和虎杖苷的順、反異構(gòu)體鑒別：以含水量80％的微乳液-甲酸-甲醇（1.0：2.0：1.0）為適宜的展開劑，其中微乳液含SDS4％。與硅膠薄層比較，分離效果明顯提高

10、。（3）蒽醌類成分的鑒別：以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（15：5：2）為展開劑可以同時(shí)分離鑒別5種蒽醌類成分。
　　 2.虎杖HPLC指紋圖譜研究:（1）以甲醇超聲提取30min為佳，具有簡(jiǎn)便、快速、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。（2）色譜柱：Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1％磷酸梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；柱溫：30℃；流速：1mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL。（3）在上述色譜條件下，虎杖苷

11、的保留時(shí)間約為12min，按虎杖苷峰計(jì)算理論板數(shù)約為30000，與其它色譜峰的分離度大于1.5。（4）精密度試驗(yàn)：以虎杖苷峰為內(nèi)參比峰，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD值分別為0.10％～0.16％和0.87％～2.4％，精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)：各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.13％～0.19％和2.0％～3.0％，重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)：各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均無明顯變化，其R

12、SD值分別為0.13％～0.30％和1.0％～3.0％，樣品溶液在室溫避光存放12h內(nèi)穩(wěn)定。（5）指紋圖譜的建立：10批不同產(chǎn)地的虎杖藥材指紋圖譜，以2號(hào)虎杖苷峰為內(nèi)參比峰（S），以其它色譜峰對(duì)內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間定性，得到14個(gè)共有峰，相似度均大于0.9。
　　 3.RP-HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的含量:（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別以虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的峰面積為縱坐標(biāo)（

13、y），濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：虎杖苷y=1.32×103x-85.8，r=0.9997；白藜蘆醇y=709x+19.5，r=0.9999；大黃素y=409x+4.05，r=0.9999；大黃素甲醚y=134x+4.46，r=0.9985，線性關(guān)系良好。（2）精密度試驗(yàn)：重復(fù)進(jìn)樣6次后，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的峰面積的RSD分別為1.4％～2.0％，精密度良好。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：虎杖苷、白藜蘆醇、大

14、黃素和大黃素甲醚的含量的RSD分別為2.2％～3.0％，重復(fù)性良好。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：樣品在室溫避光存放12h內(nèi)穩(wěn)定性良好，峰面積RSD為1.6％～2.3％。（5）加樣回收率試驗(yàn)：虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的平均回收率分別為94.4％～98.4％，RSD分別為1.3％～2.2％。各產(chǎn)地虎杖藥材中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的含量差別較大，這可能與產(chǎn)地及采收期有關(guān)。
　　 4.虎杖中白藜蘆醇和虎杖苷順反異構(gòu)體液相

15、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法的研究以乙腈和0.1％甲酸為流動(dòng)相梯度洗脫，順、反白藜蘆醇以m/z227/185、143為選擇離子檢測(cè)對(duì)象，反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇分別在保留時(shí)間為20.95min和23.73min時(shí)出峰。順、反虎杖苷以m/z389/227為選擇離子檢測(cè)對(duì)象，反式虎杖苷和順式虎杖苷分別在保留時(shí)間為10.18min和15.15min時(shí)出峰。白藜蘆醇和虎杖苷的檢測(cè)限分別為1.9×10-2和5.4×10-2μg·mL-1。本方法準(zhǔn)確、

16、簡(jiǎn)便，檢測(cè)限低，可用于虎杖白藜蘆醇和虎杖苷順、反異構(gòu)體的同時(shí)測(cè)定。
　　 5.虎杖培養(yǎng)物測(cè)定以含水量80％微乳液-甲酸-甲醇（1.0：2.0：1.0）為展開劑（其中微乳液含SDS4％），展開后由白藜蘆醇和虎杖苷的亮綠色熒光斑點(diǎn)的大小和亮度可知，經(jīng)紫外輻射的虎杖栽培苗的根含有較多的白藜蘆醇和虎杖苷，但低于四川生藥虎杖。采用本實(shí)驗(yàn)建立的含量測(cè)定的方法，得到經(jīng)紫外輻射的虎杖栽培苗的根中白藜蘆醇和虎杖苷含量分別為2.15 mg·g-1和

17、4.69 mg·g-1，而愈傷組織和毛狀根中白藜蘆醇和虎杖苷的含量較低。
　　 結(jié)論：本文建立了虎杖及其培養(yǎng)物中芪類和蒽醌類成分的微乳聚酰胺薄膜薄層色譜-熒光鑒別和同時(shí)測(cè)定這兩類成分含量的HPLC方法。方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、靈敏度較高，為虎杖藥材的分析鑒別以及虎杖培養(yǎng)物的調(diào)控篩選提供了新的方法?；⒄戎讣y圖譜的建立可用于更好的控制虎杖藥材質(zhì)量，為虎杖的鑒別提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)。本文采用指紋圖譜技術(shù)對(duì)虎杖培養(yǎng)物的共有峰進(jìn)行比對(duì)，對(duì)虎杖