PCR技術(shù)檢測(cè)肉及肉制品中金黃色葡萄球菌研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的重要病原菌之一，國(guó)內(nèi)外由金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒屢屢發(fā)生。引起食物中毒的食品多為動(dòng)物性食品、乳及乳制品等。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌仍采用傳統(tǒng)的方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要3～5天才能完成，且靈敏度較低。本研究建立了一套快速檢測(cè)肉及肉品中金黃色葡萄球菌的PCR方法，以縮短食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)時(shí)間，消除PCR反應(yīng)抑制因子，提高檢測(cè)方法的靈敏性。 本研究以金黃色葡萄球

2、菌的耐熱核酸酶基因(nuc)為靶基因，選擇特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)肉及肉制品中的金黃色葡萄球菌。對(duì)PCR反應(yīng)體系中鎂離子濃度、模板量及退火溫度和循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確定適宜PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序，其適宜反應(yīng)體系為：5μL10×PCRbuffer，4μLdNTPs混合物，1μL20μmol/L正向引物，1μL20μmol/L反向引物，最適鎂離子濃度為1.5mmol/L，0.25μL(5U/μL)Taq，水38.75μL，總反

3、應(yīng)體系50μL；其適宜PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋篜CR反應(yīng)采用冷啟動(dòng)，94℃預(yù)變性4min，再按94℃1min-58℃0.5min-72℃1.5min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3.5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2﹪的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測(cè)序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因序列的同源性達(dá)99.6﹪，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。本研究共檢測(cè)了54株菌，以驗(yàn)證引物的特異性，結(jié)

4、果表明：33株金黃色葡萄球菌中33株均為陽(yáng)性結(jié)果；21株其它菌株均為陰性結(jié)果。因此該引物特異性強(qiáng)，可用于PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌。 采用FTA濾膜制備模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其方法的靈敏度為2cfu/20μL反應(yīng)體系。 對(duì)FTA濾膜用于肉中金黃色葡萄球菌PCR直接檢測(cè)(無(wú)需增菌)模板制備的具體方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：使用FTA濾膜制備模板時(shí)，F(xiàn)TA濾膜吸附樣品，干燥后采用10﹪SDS煮沸該濾膜，可消除結(jié)合在FTA濾膜上的P

5、CR抑制因子，采用該方法制備的模板可有效的擴(kuò)增出目的基因。 采用FTA濾膜制備模板，利用PCR技術(shù)直接檢測(cè)(無(wú)需增菌)人工污染的肉及肉制品中的金黃色葡萄球菌，以確定檢出限。結(jié)果表明：豬肉、牛肉、羊肉、雞肉及熟肉制品勻漿液的檢出限均為101cfu/g?？稍?h內(nèi)完成對(duì)肉中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，比目前普遍采用的先增菌再進(jìn)行PCR檢測(cè)的方法縮短了12～24h。比較了PCR檢測(cè)肉及肉制品中金黃色葡萄球菌的7種DNA模板制備方法，結(jié)果表明

6、：FTA濾膜法可高效從樣品中提取金黃色葡萄球菌DNA，可有效的消除PCR反應(yīng)的抑制因子，靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，該方法明顯優(yōu)于其他方法。 實(shí)際檢測(cè)了72份樣品，同時(shí)與GB4789.10-94方法及兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球菌的方法做了比較，結(jié)果表明：GB4789.10-94方法檢出率為70.8﹪，檢出時(shí)間為5d，PCR方法的檢出率為73.6﹪，敏感性為100﹪，特異性為90.5﹪，符合率為97.2﹪，檢出時(shí)間為6h，Pe

7、trfilmRSA方法的檢出率為61.1﹪，敏感性為98﹪，特異性為100﹪，符合率為98.6﹪，檢出時(shí)間為18h，Baird-ParkerR.P.F方法的檢出率為69.4﹪，敏感性為86.3﹪，特異性為100﹪，符合率為90.3﹪，檢出時(shí)間為18h。因此，F(xiàn)TA濾膜用于PCR檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌檢出率高，敏感性高，耗時(shí)短。 研制出了新的FTA濾膜緩沖液，其效果明顯優(yōu)于FTA專用緩沖液，成本降低93.3﹪，大大降低了檢測(cè)成本。