LAMP技術(shù)檢測(cè)肉及肉制品中沙門(mén)氏菌的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來(lái)食品安全問(wèn)題的一個(gè)顯著特點(diǎn)，沙門(mén)氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門(mén)氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。人畜感染后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。為確保食品安全與食品貿(mào)易，需要大力加強(qiáng)食品檢驗(yàn)的力度，迫切需要建立快速、靈敏的沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)方法。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(簡(jiǎn)稱LAM

2、P)是利用4條特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。該技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)在核酸的科學(xué)研究、疾病的診斷和轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。 本研究針對(duì)已報(bào)道的沙門(mén)氏菌保守的invA基因設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性強(qiáng)的引物，對(duì)反應(yīng)體系中的Mg2+濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度、反應(yīng)溫度以及外引物與內(nèi)引物濃度比進(jìn)行優(yōu)化，以確定適宜LAMP反應(yīng)體系

3、和IrAMP擴(kuò)增程序，其適宜反應(yīng)體系為:2.5μL10xBst buffer，4μLdNTPs混合物，F(xiàn)IP、BIP引物各4μL，F(xiàn)3、B3引物各0.5μL，適宜鎂離子濃度為2.5mmol/L，1μLBSt鏈置換聚合酶，4μL甜菜堿，模板DNA2μL，雙蒸水2μL，總反應(yīng)體系25μL。63℃保溫1h，觀察反應(yīng)結(jié)果。 比較了LAMP檢測(cè)肉及肉制品中沙門(mén)氏菌的7種模板制備方法，表明FTA濾膜法可高效從樣品中提取沙門(mén)氏菌DNA，可有效

4、的消除LAMP反應(yīng)的抑制因子，靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，該方法明顯優(yōu)于其他方法。比較了LAMP方法與PCR方法檢測(cè)人工污染肉制品的檢出限，LAMP方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的檢出限為3cfu/μL，而PCR法的檢出限為300cfu/μL，LAMP法的檢出限比PCR法的檢出限低100倍，是高效的檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法。 實(shí)際檢測(cè)了48份樣品，同時(shí)與PCR及國(guó)標(biāo)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法做了比較，結(jié)果表明:國(guó)標(biāo)法檢出率為85.4％，檢出時(shí)間為5d，PC