應用大鼠急性痛風性關節(jié)炎和高尿酸血癥模型研究三妙丸方中牛膝“引藥下行”作用.pdf

1、三妙丸（Sanmiao Wan，SMW）源于二妙丸（治療痛風的基礎方），首次記載見于《醫(yī)學正傳》（虞摶，明代）一書，因其具有清熱、燥濕、消腫、止痛等功效，一直作為中醫(yī)治療關節(jié)痹病的常用方劑使用，且在《中國藥典》歷版中均有收錄。三妙丸方由黃柏、蒼術和牛膝按照質(zhì)量比例2:3:1組成。方中黃柏為君藥，起主要治療作用，且不可或缺，其抗炎活性成分以小檗堿、藥根堿、巴馬汀等原小檗堿型生物堿類為主；蒼術為臣藥，輔助君藥發(fā)揮藥效，其有效成分為揮發(fā)油類（

2、β-桉葉醇，蒼術素等）；牛膝為佐使藥，引藥下行，能夠引導蒼術、黃柏入下焦或下肢，促進三妙丸中其他有效成分向下肢靶組織或器官分布，尤其能提高病位在下肢的疾病的療效，其有效成分主要是分為兩類：甾酮類（β-蛻皮甾酮、25-R牛膝甾酮）和三萜皂苷類（竹節(jié)參皂苷 IVa，三七皂苷 R1）?；谌钔枧R床主要用于治療痛風和高尿酸血癥，本文運用尿酸鈉晶體誘導的痛風模型和次黃嘌呤誘導的高尿酸血癥模型，通過藥效學和有效成分的組織分布研究相結合，旨在研究三

3、妙丸方中牛膝的引藥下行作用。本研究選擇小檗堿和藥根堿等兩種生物堿作為黃柏的有效指標成分，建立一種靈敏、可靠的超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法同時測定多次給藥三妙丸去牛膝組和三妙丸含牛膝組后，大鼠血漿和組織（心、肝、脾、肺、腎、膝關節(jié)、踝關節(jié)）中小檗堿和藥根堿成分的分布情況，并結合給藥后對急性痛風性關節(jié)炎大鼠膝關節(jié)腫脹程度、關節(jié)滑膜組織增生、炎細胞浸潤等藥效學特點，探討牛膝引藥下行在痛風性關節(jié)炎模型中所起的作用。具體研究工作如下：
　　第一

4、部分牛膝“引藥下行”對三妙丸治療大鼠急性痛風性關節(jié)炎和高尿酸血癥的影響
　　本研究通過比較三妙丸去牛膝組和三妙丸含高、中、低劑量牛膝組給藥后對急性痛風性關節(jié)炎和高尿酸血癥大鼠的療效，證明牛膝引藥下行對提高三妙丸藥效的影響。普通級雄性SD大鼠，隨機均分為6組：對照組、模型組、三妙丸去牛膝組（10 g/kg）、三妙丸牛膝低劑量組（12 g/kg）、三妙丸牛膝中劑量組（14 g/kg）和三妙丸牛膝高劑量組（18 g/kg）。四組藥物治療

5、組大鼠連續(xù)灌胃給藥5天。于第2天灌胃后造模，即向模型組和四組給藥組大鼠的膝關節(jié)腔內(nèi)注射尿酸鈉混懸液（0.2 mL，20 mg/mL），建立急性痛風性關節(jié)炎模型，觀察三妙丸去牛膝組和三妙丸含牛膝組對實驗性急性痛風性關節(jié)炎大鼠膝關節(jié)造模前后直徑的變化和膝關節(jié)組織病理形態(tài)學影響的差異性。腹腔注射次黃嘌呤（700 mg/kg）制備大鼠高尿酸血癥模型，并觀察給藥三妙丸去牛膝組和三妙丸含牛膝組對血清尿酸水平的影響。結果表明，與對照組比較，大鼠關節(jié)腔

6、注射尿酸鈉混懸液后，模型組大鼠的膝關節(jié)腫脹明。HE染色結果表明，模型組滑膜增生和炎癥細胞浸潤嚴重；與模型組比較，各給藥組腫脹度，滑膜增生和炎細胞浸潤情況均有不同程度的減輕，且三妙丸含牛膝組較三妙丸去牛膝組療效明顯，在三妙丸含牛膝組中，隨著牛膝劑量增加，療效逐漸得到提高。各組給藥后均能降低高尿酸血癥大鼠血清尿酸水平，其中三妙丸含牛膝組給藥后降尿酸作用較去牛膝組好。而且隨著牛膝劑量的增加，大鼠血清尿酸水平呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。因此，三妙丸含引

7、藥下行之牛膝能進一步改善大鼠急性痛風炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)更強的降尿酸作用。更重要的是，本研究中亦觀察到牛膝引藥下行具有劑量依耐性。牛膝作為下肢疾病的引經(jīng)藥，有利于實現(xiàn)其他藥物的下肢靶向給藥。本文研究結果為牛膝引藥下行作用的臨床應用提供依據(jù)。
　　第二部分運用UPLC–MS/MS研究牛膝“引藥下行”對三妙丸中小檗堿和藥根堿的組織分布的影響
　　本研究旨在探討三妙丸方中牛膝引藥下行作用對君藥黃柏有效成分小檗堿和藥根堿在大鼠體內(nèi)血漿和組

8、織分布的影響。四組給藥組大鼠連續(xù)五天分別灌胃給藥三妙丸去牛膝組（10 g/kg）、三妙丸牛膝低劑量組（12 g/kg）、三妙丸牛膝中劑量組（14 g/kg）和三妙丸牛膝高劑量組（18 g/kg）后，采用UPLC-MS/MS法測定大鼠血漿和心、肝、脾、肺、腎、膝關節(jié)、踝關節(jié)等組織中生物堿類成分的分布情況。液相色譜儀使用島津Inertsil ODS-3/C18色譜柱（50×2.1 mm I.D.，2μm），以1％甲酸水（A相），乙腈（B相）

9、進行梯度洗脫，流速0.3 mL/min。使用AB SCIEX5500三重四級桿質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ESI），采用多反應監(jiān)測（MRM）模式。結果表明，與三妙丸去牛膝組比較，給藥三妙丸含低、中、高劑量牛膝組后，血漿小檗堿濃度分別增加19.81%，143.40%和681.13%，三妙丸含牛膝組大鼠體內(nèi)小檗堿在心、肺等組織中分布較去牛膝組減少，在肝、腎等組織中分布較去牛膝組增多。更有趣的是，牛膝明顯增加小檗堿在下肢（膝關節(jié)、踝關節(jié)）的分布，其