NRF2-HO-1通路介導(dǎo)復(fù)方金錢草對小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的實驗研究.pdf

1、一、研究背景
　　 泌尿系結(jié)石是我國南方青壯年人群的常見病，其患病率高達4.87％～10％以上，而腎結(jié)石主要成分是一水草酸鈣結(jié)晶，約占結(jié)石總數(shù)的80％。隨著外科技術(shù)的發(fā)展，腎結(jié)石的治療手段已經(jīng)日益多樣化，但其病因機制尚不清楚，目前仍然沒有預(yù)防其發(fā)生和復(fù)發(fā)的有效方法，給社會經(jīng)濟造成巨大負(fù)擔(dān)。目前的研究認(rèn)為，腎結(jié)石的形成主要是成石因素與抑石因素兩種對比力量失衡的結(jié)果，其中尿中成石物質(zhì)濃度超飽和后析出結(jié)晶和尿結(jié)晶的黏附對腎小管上皮損傷

2、是結(jié)石生成的兩個必備條件，草酸鈣結(jié)晶體對腎小管上皮損傷的具體病理生理過程為:草酸鈣結(jié)晶→NADPH氧化酶的激活→ROS增加→親環(huán)蛋白D的激活→線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放→線粒體膜電位下降，線粒體的死亡→細(xì)胞色素C激活→ Caspase-3的激活→細(xì)胞受損→細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸結(jié)構(gòu)的改變→腎臟結(jié)晶的粘附，而后受損傷的細(xì)胞逐步變?yōu)樗槠?，成為核聚集的“大本營”，接著大分子物質(zhì)迅速而牢固地黏附于其上，最終啟動結(jié)石的級聯(lián)反應(yīng)，此時啟動細(xì)胞多種抗氧化防

3、御反應(yīng)是至關(guān)重要的。
　　 Nuclear factor erythroid2-related factor2(NRF2)是具有基本亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，它通過與稱作抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element，ARE)的一段增強子序列結(jié)合而誘導(dǎo)多種Ⅱ相解毒酶基因的協(xié)同表達。為了阻斷脂質(zhì)過氧化物的發(fā)生和發(fā)展，對抗其產(chǎn)生的損害作用，機體自身能誘導(dǎo)出一系列保護性蛋白，如超氧化物歧化酶(Superox

4、ide dismutase，SOD)、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase，HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH)等，以減輕細(xì)胞所受的損害，而這協(xié)調(diào)反應(yīng)是由NRF2-ARE通路來調(diào)控的。目前認(rèn)為NRF2是調(diào)控細(xì)胞對抗氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，NRF2缺失或激活障礙，會加重侵害物質(zhì)對細(xì)胞的損傷，HO-1是Ⅱ相解毒酶最容易受誘導(dǎo)的抗氧化防御酶，能有效消除氧自由基，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化

5、和NADPH的氧化活性，上調(diào)抗凋亡蛋白的表達，減輕線粒體損傷，保護內(nèi)皮細(xì)胞免受過氧化物質(zhì)侵害引起的細(xì)胞凋亡。近年研究揭示NRF2/HO-1通路是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路之一，上調(diào)此信號通路可誘導(dǎo)多種抗氧化酶及解毒酶，加速酶促反應(yīng)，提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物質(zhì)的表達水平，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，發(fā)揮細(xì)胞保護作用。
　　 復(fù)方金錢草為報春花科植物過路黃的干燥全草，作為排石之要藥，已有200多年的應(yīng)用歷史，現(xiàn)代藥

6、理學(xué)研究證實，復(fù)方金錢草具有抑制草酸鈣形成并增加其排泄，清除羥自由基氧，超氧自由基及抗脂質(zhì)，對抗鈣離子的失衡，改善組織的缺氧，抗炎癥作用。其臨床治療尿結(jié)石的作用已得到不斷驗證，但其作用機理尚未完全清楚。鑒于此，本項研究擬分析復(fù)方金錢草對小鼠草酸鈣結(jié)晶性腎損傷模型的作用及可能的作用機制。
　　 二、研究目的
　　 （一）、通過腹腔注射乙醛酸鹽的方法誘導(dǎo)建立實驗性小鼠腎草酸鈣結(jié)晶模型，觀察對腎臟的損害情況，并采用復(fù)方金錢草進

7、行體內(nèi)干預(yù)實驗，初步探討復(fù)方金錢草對小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的保護作用。
　　 （二）、在小鼠腎草酸鈣結(jié)晶模型建立后，觀察其NRF2/HO-1蛋白的動態(tài)變化情況，探討NRF2/HO-1通路是否參與腎草酸鈣結(jié)晶腎損傷的發(fā)病機制。
　　 （三）、進一步探討復(fù)方金錢草是否通過NRF2/HO-1通路起到了抗氧化應(yīng)激的作用。
　　 三、研究內(nèi)容
　　 第一部分復(fù)方金錢草對小鼠草酸鈣結(jié)晶腎損傷的保護作用
　　 7

8、～8周齡野生型雄性C57BL/6小鼠24只，將動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，按隨機數(shù)字表法隨機分為對照組（A組）、單純結(jié)晶組（B組）、復(fù)方金錢草干預(yù)組（C組），每組8只。B組:給予100mg/Kg乙醛酸鹽;C組:給予100mg/Kg乙醛酸鹽+20mlL/Kg復(fù)方金錢草浸膏;A組:給予100mg/Kg的生理鹽水;乙醛酸鹽與復(fù)方金錢草給藥間隔10小時，給藥方式:乙醛酸鹽為腹腔注射，復(fù)方金錢草浸膏為灌胃，連續(xù)給藥7天。第8天處死全部小鼠，內(nèi)眥靜脈取血

9、，靜置1小時后離心取血清，隨后用生理鹽水行心臟灌流，使腎臟干凈，左側(cè)腎臟縱行剖開一份即刻存放在液氮中，另一側(cè)取皮髓質(zhì)交界處組織送檢。之后使用甲醛進行右側(cè)腎臟內(nèi)固定，取出腎臟并浸泡在4％的多聚甲醛液中用于病理分析。檢測各組小鼠腎組織鈣含量、GXH、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的表達水平及過氧化氫酶(Catalase，CAT)、CuZn-SOD活性變化，全自動生化分析儀測定血清尿素氮(Serum urea nitroge

10、n，BUN)及肌酐(Serum creatinine，SCr)水平，采用Caraway雙盲病理評分，評價各組小鼠腎臟損傷程度，馮庫薩(VON KOSSA)染色，觀察小鼠腎臟結(jié)晶程度，免疫組織化學(xué)法對各組小鼠腎組織鈣離子轉(zhuǎn)運通道蛋白V5(Transient receptor potential cation channel V5，TRPV5)、腎臟組織骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、跨膜糖蛋白(Hyaluronan，CD44)

11、進行定位檢測;免疫熒光法對鈣結(jié)合蛋白(Calbindin-D28k)進行定位分析，Western blot法檢測各組腎組織中TRPV5、Calbindin-D28k、OPN、CD44、Caspase-3和Bcl-2含量，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測各組小鼠腎臟小管上皮細(xì)胞凋亡情況，增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating CellNuclear Antigen，PCNA)免疫組化法檢測各組小鼠腎臟小管上皮細(xì)胞增殖情況。
　　 第

12、二部分NRF2/HO-1通路參與草酸鈣結(jié)晶腎損傷的過程
　　 48只雄性C57BL/6小鼠，按取材時相點隨機分為6組分別為:0h組、24h組，48h組，72h組、96h組、120h組、每組8只。0h組正常飼養(yǎng)，其余各組每間隔24h分別給予100mg/Kg乙醛酸鹽，給藥方式均為腹腔注射，各組小鼠于給藥后相對應(yīng)的時刻即0h、24h、48h、72h、96h、120h等5個時相點，處死全部小鼠，隨后采用第一部分?jǐn)⑹龅姆椒ㄌ幚硇∈髽?biāo)本及組

13、織并測定各組小鼠腎組織HO-1活性變化，馮庫薩染色，觀察小鼠腎臟結(jié)晶程度，Real time PCR法分析HO-1mRNA和NRF2mRNA表達水平;Westernblot法檢測各組腎組織中HO-1、NRF2蛋白含量。
　　 第三部分NRF2/HO-1通路介導(dǎo)復(fù)方金錢草對草酸鈣結(jié)晶腎損傷的保護作用
　　 56只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為7組分別為:對照組（A組）、單純Hemin組(B組)、結(jié)晶+Hemin組（C組）

14、、單純復(fù)方金錢草組（D組）、單純結(jié)晶組（E組）、結(jié)晶+復(fù)方金錢草組（F組）、結(jié)晶+復(fù)方金錢草+Snpp組（G組），每組8只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，對照組正常飼養(yǎng):給予100mg/Kg的生理鹽水;單純結(jié)晶組:給予100mg/Kg乙醛酸鹽;單純復(fù)方金錢草組:給予20ml/Kg復(fù)方金錢草浸膏;單純Hemin組（HO-1的誘導(dǎo)劑）:給予Hemin301μmol/kg;結(jié)晶+復(fù)方金錢草組:先給予20ml/Kg復(fù)方金錢草浸膏，后給予100mg/Kg乙醛酸

15、鹽;結(jié)晶+Hemin組:先給予Hemin30μmol/kg，后給予100mg/Kg乙醛酸鹽;結(jié)晶+復(fù)方金錢草+Snpp組（HO-1的抑制劑）:先給予20ml/Kg復(fù)方金錢草浸膏，后給予100mg/Kg乙醛酸鹽，而后給予25mg/kgSnpp。乙醛酸鹽、Hemin、Snpp給藥方式為腹腔注射，復(fù)方金錢草為灌胃，24h后處死全部小鼠，隨后采用第一部分?jǐn)⑹龅姆椒ㄌ幚硇∈髽?biāo)本及組織。測定各組小鼠腎組織HO-1活性變化，免疫組織化學(xué)法對小鼠腎臟H

16、O-1進行定位檢測，Real time PCR法分析HO-1 mRNA、NRF2mRNA、KEAP-1 mRNA表達水平;Westem blot法檢測各組腎組織中HO-1、NRF2和KEAP-1蛋白含量。
　　 四、研究結(jié)果
　　 第一部分
　　 血生化結(jié)果顯示:單純結(jié)晶組BUN、SCr值比對照組有明顯升高，而復(fù)方金錢草治療組BUN、SCr值明顯低于單純結(jié)晶組相比，本實驗亦發(fā)現(xiàn)，單純結(jié)晶組MDA、腎鈣含量比正常對

17、照組顯著升高，復(fù)方金錢草治療組的SOD、CAT、GSH較單純結(jié)晶組小鼠有明顯的提高，而MDA、腎鈣含量有顯著下降，并且減少了鈣鹽的沉積。
　　 免疫組化及免疫印跡蛋白結(jié)果顯示:OPN及CD44在所有3組中均有表達，與A組相比，B組及C組腎組織中的OPN及CD44表達明顯增多，但C組腎組織中OPN及CD44表達強度弱于B組。免疫印跡蛋白及免疫組化結(jié)果顯示:與對照組相比，單純結(jié)晶組小鼠表達的TRPV5和Calbindin-D28k明

18、顯減弱，結(jié)晶+復(fù)方金錢草組發(fā)現(xiàn)其TRPV5和Calbindin-D28k表達量雖弱于對照組，但強于單純結(jié)晶組。
　　 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測及PCNA免疫組化法顯示，單純結(jié)晶組小鼠出現(xiàn)較多腎臟上皮細(xì)胞凋亡，而結(jié)晶+復(fù)方金錢草組較單純結(jié)晶組明顯減少，與對照組相比，單純結(jié)晶組的腎組織細(xì)胞增殖則明顯減弱，結(jié)晶+復(fù)方金錢草組發(fā)現(xiàn)其腎組織細(xì)胞增殖雖弱于對照組，但強于單純結(jié)晶組。免疫印跡蛋白技術(shù)檢測結(jié)果顯示:與對照組比較，單純結(jié)晶組小鼠

19、腎臟組織內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白活化型Caspase-3表達顯著增加，抗凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2表達亦顯著增加;而結(jié)晶+復(fù)方金錢草小鼠腎組織活化型Caspase-3表達明顯下降，而Bcl-2表達較單純結(jié)晶組顯著增加。
　　 第二部分
　　 本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在給予小鼠乙醛酸鹽誘導(dǎo)后，其腎臟鈣鹽的沉積在24h、48h時相點我們并沒有觀察到結(jié)晶體沉積，而在72h時相點小鼠腎小管腔中出現(xiàn)少量結(jié)晶體，96h時相點小鼠腎小管腔中出現(xiàn)較多結(jié)晶體，

20、120h時相點可見皮髓交界處大量的黑色鈣鹽結(jié)晶體沉積小管腔內(nèi)，小鼠腎組織HO-1活性測定結(jié)果顯示，在給予乙醛酸鹽誘導(dǎo)后24h后其活性達到高峰，而后其活性隨著時間的延長，逐漸的下降，Westernblot及其PCR方法結(jié)果顯示，在24h時相點HO-1、NRF2蛋白表達量及其mRNA達到高峰，而后隨著時間的延長，含量逐漸的下降。
　　 第三部分
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:各組小鼠的腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜均有棕黃色的陽性染色

21、顆粒，但B、C、D、E、F、G組的陽性染色強度顯著高于A組;B、C組的陽性染色強度高于D、E、F、G組，但D、E、F、G組未見有差異。
　　 腎組織HO-1活性結(jié)果顯示:與A組相比，B、C、D、E、F組小鼠腎組織HO-1活性顯著增加;而G組顯著下降;與G組相比，B、C、D、E、F組小鼠腎組織HO-1活性顯著增加， B、C兩組腎組織HO-1活性顯著強于D、E、F組，但D、E、F組之間腎組織HO-1活性沒有顯著性差異;B、C組之間也

22、沒有顯著性差異。
　　 RT-PCR及免疫印跡蛋白結(jié)果顯示，B、C、D、E、F、G組小鼠腎組織HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表達量顯著強于A組;B、C兩組HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表達量顯著強于D、E、F、G組，但D、E、F、G組之間HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表達量無顯著性差異，B、C組之間也沒有顯著性差異。
　　 五、研究結(jié)論
　　 （一）復(fù)方金錢草可能通

23、過抑制過氧化應(yīng)激途徑減輕小鼠草酸鈣結(jié)晶性腎損傷，抑制促凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3活化、誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，減少細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞增殖，起到了保護腎小管上皮細(xì)胞的作用，可能通過上調(diào)腎臟TRPV5及Calbindin-D28k的表達量降低尿液中鈣離子的含量，從而減少草酸鈣結(jié)晶的形成。
　　 （二）NRF2/HO-1通路可能參與草酸鈣結(jié)晶腎損傷的過程，而復(fù)方金錢草可能通過激活KEAP-1/NRF2/ARE信號通路，最終誘