NRF2-HO-1通路介導復方金錢草對小鼠草酸鈣結晶腎損傷的實驗研究.pdf

1、一、研究背景
　　 泌尿系結石是我國南方青壯年人群的常見病，其患病率高達4.87％～10％以上，而腎結石主要成分是一水草酸鈣結晶，約占結石總數(shù)的80％。隨著外科技術的發(fā)展，腎結石的治療手段已經(jīng)日益多樣化，但其病因機制尚不清楚，目前仍然沒有預防其發(fā)生和復發(fā)的有效方法，給社會經(jīng)濟造成巨大負擔。目前的研究認為，腎結石的形成主要是成石因素與抑石因素兩種對比力量失衡的結果，其中尿中成石物質濃度超飽和后析出結晶和尿結晶的黏附對腎小管上皮損傷

2、是結石生成的兩個必備條件，草酸鈣結晶體對腎小管上皮損傷的具體病理生理過程為:草酸鈣結晶→NADPH氧化酶的激活→ROS增加→親環(huán)蛋白D的激活→線粒體通透性轉換孔的開放→線粒體膜電位下降，線粒體的死亡→細胞色素C激活→ Caspase-3的激活→細胞受損→細胞膜磷脂酰絲氨酸結構的改變→腎臟結晶的粘附，而后受損傷的細胞逐步變?yōu)樗槠?，成為核聚集的“大本營”，接著大分子物質迅速而牢固地黏附于其上，最終啟動結石的級聯(lián)反應，此時啟動細胞多種抗氧化防

3、御反應是至關重要的。
　　 Nuclear factor erythroid2-related factor2(NRF2)是具有基本亮氨酸拉鏈結構的核轉錄因子，它通過與稱作抗氧化反應元件(Antioxidant response element，ARE)的一段增強子序列結合而誘導多種Ⅱ相解毒酶基因的協(xié)同表達。為了阻斷脂質過氧化物的發(fā)生和發(fā)展，對抗其產(chǎn)生的損害作用，機體自身能誘導出一系列保護性蛋白，如超氧化物歧化酶(Superox

4、ide dismutase，SOD)、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase，HO-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH)等，以減輕細胞所受的損害，而這協(xié)調反應是由NRF2-ARE通路來調控的。目前認為NRF2是調控細胞對抗氧化損傷的關鍵轉錄因子之一，NRF2缺失或激活障礙，會加重侵害物質對細胞的損傷，HO-1是Ⅱ相解毒酶最容易受誘導的抗氧化防御酶，能有效消除氧自由基，抑制細胞脂質過氧化

5、和NADPH的氧化活性，上調抗凋亡蛋白的表達，減輕線粒體損傷，保護內皮細胞免受過氧化物質侵害引起的細胞凋亡。近年研究揭示NRF2/HO-1通路是細胞內重要的內源性抗氧化應激通路之一，上調此信號通路可誘導多種抗氧化酶及解毒酶，加速酶促反應，提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物質的表達水平，維持細胞內的氧化還原狀態(tài)，發(fā)揮細胞保護作用。
　　 復方金錢草為報春花科植物過路黃的干燥全草，作為排石之要藥，已有200多年的應用歷史，現(xiàn)代藥

6、理學研究證實，復方金錢草具有抑制草酸鈣形成并增加其排泄，清除羥自由基氧，超氧自由基及抗脂質，對抗鈣離子的失衡，改善組織的缺氧，抗炎癥作用。其臨床治療尿結石的作用已得到不斷驗證，但其作用機理尚未完全清楚。鑒于此，本項研究擬分析復方金錢草對小鼠草酸鈣結晶性腎損傷模型的作用及可能的作用機制。
　　 二、研究目的
　　 （一）、通過腹腔注射乙醛酸鹽的方法誘導建立實驗性小鼠腎草酸鈣結晶模型，觀察對腎臟的損害情況，并采用復方金錢草進

7、行體內干預實驗，初步探討復方金錢草對小鼠草酸鈣結晶腎損傷的保護作用。
　　 （二）、在小鼠腎草酸鈣結晶模型建立后，觀察其NRF2/HO-1蛋白的動態(tài)變化情況，探討NRF2/HO-1通路是否參與腎草酸鈣結晶腎損傷的發(fā)病機制。
　　 （三）、進一步探討復方金錢草是否通過NRF2/HO-1通路起到了抗氧化應激的作用。
　　 三、研究內容
　　 第一部分復方金錢草對小鼠草酸鈣結晶腎損傷的保護作用
　　 7

8、～8周齡野生型雄性C57BL/6小鼠24只，將動物適應性喂養(yǎng)7天后，按隨機數(shù)字表法隨機分為對照組（A組）、單純結晶組（B組）、復方金錢草干預組（C組），每組8只。B組:給予100mg/Kg乙醛酸鹽;C組:給予100mg/Kg乙醛酸鹽+20mlL/Kg復方金錢草浸膏;A組:給予100mg/Kg的生理鹽水;乙醛酸鹽與復方金錢草給藥間隔10小時，給藥方式:乙醛酸鹽為腹腔注射，復方金錢草浸膏為灌胃，連續(xù)給藥7天。第8天處死全部小鼠，內眥靜脈取血

9、，靜置1小時后離心取血清，隨后用生理鹽水行心臟灌流，使腎臟干凈，左側腎臟縱行剖開一份即刻存放在液氮中，另一側取皮髓質交界處組織送檢。之后使用甲醛進行右側腎臟內固定，取出腎臟并浸泡在4％的多聚甲醛液中用于病理分析。檢測各組小鼠腎組織鈣含量、GXH、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的表達水平及過氧化氫酶(Catalase，CAT)、CuZn-SOD活性變化，全自動生化分析儀測定血清尿素氮(Serum urea nitroge

10、n，BUN)及肌酐(Serum creatinine，SCr)水平，采用Caraway雙盲病理評分，評價各組小鼠腎臟損傷程度，馮庫薩(VON KOSSA)染色，觀察小鼠腎臟結晶程度，免疫組織化學法對各組小鼠腎組織鈣離子轉運通道蛋白V5(Transient receptor potential cation channel V5，TRPV5)、腎臟組織骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、跨膜糖蛋白(Hyaluronan，CD44)

11、進行定位檢測;免疫熒光法對鈣結合蛋白(Calbindin-D28k)進行定位分析，Western blot法檢測各組腎組織中TRPV5、Calbindin-D28k、OPN、CD44、Caspase-3和Bcl-2含量，原位末端轉移酶標記技術檢測各組小鼠腎臟小管上皮細胞凋亡情況，增殖細胞核抗原(Proliferating CellNuclear Antigen，PCNA)免疫組化法檢測各組小鼠腎臟小管上皮細胞增殖情況。
　　 第

12、二部分NRF2/HO-1通路參與草酸鈣結晶腎損傷的過程
　　 48只雄性C57BL/6小鼠，按取材時相點隨機分為6組分別為:0h組、24h組，48h組，72h組、96h組、120h組、每組8只。0h組正常飼養(yǎng)，其余各組每間隔24h分別給予100mg/Kg乙醛酸鹽，給藥方式均為腹腔注射，各組小鼠于給藥后相對應的時刻即0h、24h、48h、72h、96h、120h等5個時相點，處死全部小鼠，隨后采用第一部分敘述的方法處理小鼠標本及組

13、織并測定各組小鼠腎組織HO-1活性變化，馮庫薩染色，觀察小鼠腎臟結晶程度，Real time PCR法分析HO-1mRNA和NRF2mRNA表達水平;Westernblot法檢測各組腎組織中HO-1、NRF2蛋白含量。
　　 第三部分NRF2/HO-1通路介導復方金錢草對草酸鈣結晶腎損傷的保護作用
　　 56只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為7組分別為:對照組（A組）、單純Hemin組(B組)、結晶+Hemin組（C組）

14、、單純復方金錢草組（D組）、單純結晶組（E組）、結晶+復方金錢草組（F組）、結晶+復方金錢草+Snpp組（G組），每組8只，適應性喂養(yǎng)7天，對照組正常飼養(yǎng):給予100mg/Kg的生理鹽水;單純結晶組:給予100mg/Kg乙醛酸鹽;單純復方金錢草組:給予20ml/Kg復方金錢草浸膏;單純Hemin組（HO-1的誘導劑）:給予Hemin301μmol/kg;結晶+復方金錢草組:先給予20ml/Kg復方金錢草浸膏，后給予100mg/Kg乙醛酸

15、鹽;結晶+Hemin組:先給予Hemin30μmol/kg，后給予100mg/Kg乙醛酸鹽;結晶+復方金錢草+Snpp組（HO-1的抑制劑）:先給予20ml/Kg復方金錢草浸膏，后給予100mg/Kg乙醛酸鹽，而后給予25mg/kgSnpp。乙醛酸鹽、Hemin、Snpp給藥方式為腹腔注射，復方金錢草為灌胃，24h后處死全部小鼠，隨后采用第一部分敘述的方法處理小鼠標本及組織。測定各組小鼠腎組織HO-1活性變化，免疫組織化學法對小鼠腎臟H

16、O-1進行定位檢測，Real time PCR法分析HO-1 mRNA、NRF2mRNA、KEAP-1 mRNA表達水平;Westem blot法檢測各組腎組織中HO-1、NRF2和KEAP-1蛋白含量。
　　 四、研究結果
　　 第一部分
　　 血生化結果顯示:單純結晶組BUN、SCr值比對照組有明顯升高，而復方金錢草治療組BUN、SCr值明顯低于單純結晶組相比，本實驗亦發(fā)現(xiàn)，單純結晶組MDA、腎鈣含量比正常對

17、照組顯著升高，復方金錢草治療組的SOD、CAT、GSH較單純結晶組小鼠有明顯的提高，而MDA、腎鈣含量有顯著下降，并且減少了鈣鹽的沉積。
　　 免疫組化及免疫印跡蛋白結果顯示:OPN及CD44在所有3組中均有表達，與A組相比，B組及C組腎組織中的OPN及CD44表達明顯增多，但C組腎組織中OPN及CD44表達強度弱于B組。免疫印跡蛋白及免疫組化結果顯示:與對照組相比，單純結晶組小鼠表達的TRPV5和Calbindin-D28k明

18、顯減弱，結晶+復方金錢草組發(fā)現(xiàn)其TRPV5和Calbindin-D28k表達量雖弱于對照組，但強于單純結晶組。
　　 原位末端轉移酶標記技術檢測及PCNA免疫組化法顯示，單純結晶組小鼠出現(xiàn)較多腎臟上皮細胞凋亡，而結晶+復方金錢草組較單純結晶組明顯減少，與對照組相比，單純結晶組的腎組織細胞增殖則明顯減弱，結晶+復方金錢草組發(fā)現(xiàn)其腎組織細胞增殖雖弱于對照組，但強于單純結晶組。免疫印跡蛋白技術檢測結果顯示:與對照組比較，單純結晶組小鼠

19、腎臟組織內凋亡關鍵蛋白活化型Caspase-3表達顯著增加，抗凋亡關鍵蛋白Bcl-2表達亦顯著增加;而結晶+復方金錢草小鼠腎組織活化型Caspase-3表達明顯下降，而Bcl-2表達較單純結晶組顯著增加。
　　 第二部分
　　 本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在給予小鼠乙醛酸鹽誘導后，其腎臟鈣鹽的沉積在24h、48h時相點我們并沒有觀察到結晶體沉積，而在72h時相點小鼠腎小管腔中出現(xiàn)少量結晶體，96h時相點小鼠腎小管腔中出現(xiàn)較多結晶體，

20、120h時相點可見皮髓交界處大量的黑色鈣鹽結晶體沉積小管腔內，小鼠腎組織HO-1活性測定結果顯示，在給予乙醛酸鹽誘導后24h后其活性達到高峰，而后其活性隨著時間的延長，逐漸的下降，Westernblot及其PCR方法結果顯示，在24h時相點HO-1、NRF2蛋白表達量及其mRNA達到高峰，而后隨著時間的延長，含量逐漸的下降。
　　 第三部分
　　 免疫組織化學結果顯示:各組小鼠的腎小管上皮細胞的細胞膜均有棕黃色的陽性染色

21、顆粒，但B、C、D、E、F、G組的陽性染色強度顯著高于A組;B、C組的陽性染色強度高于D、E、F、G組，但D、E、F、G組未見有差異。
　　 腎組織HO-1活性結果顯示:與A組相比，B、C、D、E、F組小鼠腎組織HO-1活性顯著增加;而G組顯著下降;與G組相比，B、C、D、E、F組小鼠腎組織HO-1活性顯著增加， B、C兩組腎組織HO-1活性顯著強于D、E、F組，但D、E、F組之間腎組織HO-1活性沒有顯著性差異;B、C組之間也

22、沒有顯著性差異。
　　 RT-PCR及免疫印跡蛋白結果顯示，B、C、D、E、F、G組小鼠腎組織HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表達量顯著強于A組;B、C兩組HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表達量顯著強于D、E、F、G組，但D、E、F、G組之間HO-1、NRF2、KEAP-1蛋白及mRNA表達量無顯著性差異，B、C組之間也沒有顯著性差異。
　　 五、研究結論
　　 （一）復方金錢草可能通

23、過抑制過氧化應激途徑減輕小鼠草酸鈣結晶性腎損傷，抑制促凋亡關鍵蛋白Caspase-3活化、誘導抗凋亡蛋白Bcl-2表達，減少細胞凋亡，促進細胞增殖，起到了保護腎小管上皮細胞的作用，可能通過上調腎臟TRPV5及Calbindin-D28k的表達量降低尿液中鈣離子的含量，從而減少草酸鈣結晶的形成。
　　 （二）NRF2/HO-1通路可能參與草酸鈣結晶腎損傷的過程，而復方金錢草可能通過激活KEAP-1/NRF2/ARE信號通路，最終誘