水稻PHD-finger家族低溫誘導(dǎo)基因的鑒定與啟動(dòng)子功能分析.pdf

1、水稻是世界上重要的糧食作物之一，水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)關(guān)系到國(guó)家安全。低溫等非生物脅迫是水稻等糧食作物產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降的重要影響因子。利用基因工程定向培育和改良水稻抗性品種可以大大縮短抗逆育種進(jìn)程。發(fā)掘水稻內(nèi)源性抗逆功能基因并應(yīng)用于抗逆新品種的選育，是提高水稻逆境耐受力和適應(yīng)性的有效途徑。轉(zhuǎn)錄因子在植物參與逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制中扮演了極為重要的角色。轉(zhuǎn)錄因子及其功能的研究已逐漸成為植物抗逆遺傳改良方法的研究熱點(diǎn)。
　　PHD-finger

2、轉(zhuǎn)錄因子是一類廣泛存在于真核生物中的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，其功能研究多集中在基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)等方面，而關(guān)于其參與脅迫應(yīng)答的報(bào)道較少。因此，從全基因組水平系統(tǒng)、全面的研究水稻 PHD-finger轉(zhuǎn)錄因子，挖掘響應(yīng)低溫等非生物脅迫的相關(guān)基因，并解析其抗逆機(jī)理，對(duì)于開(kāi)展水稻抗逆育種改良具有重要意義。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法水稻全基因組進(jìn)行分析，對(duì) PHD-finger轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行鑒定，系統(tǒng)分析了這些基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系以及不同逆

3、境（低溫、干旱、高鹽）處理下的誘導(dǎo)表達(dá)模式，從中篩選出了2個(gè)響應(yīng)低溫脅迫的基因，并對(duì)它們的啟動(dòng)子進(jìn)行功能分析，研究其作用機(jī)制。具體研究結(jié)果如下：
　　1.通過(guò)Blast同源搜索，從水稻全基因水平上共鑒定出58個(gè)PHD-finger轉(zhuǎn)錄因子，染色體物理定位結(jié)果表明這些基因在水稻11條染色體上（第10號(hào)染色體除外）的分布并不均勻，有接近1/5的成員分布在異染色質(zhì)區(qū)。該家族中有6對(duì)基因?qū)儆谄螐?fù)制，這對(duì)家族基因數(shù)量的擴(kuò)張有一定貢獻(xiàn)。根據(jù)

4、保守結(jié)構(gòu)域采用NJ法繪制了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，58個(gè)基因進(jìn)一步被分成了6個(gè)亞族，基因結(jié)構(gòu)分析表明同一亞族內(nèi)的成員具有相似或相同結(jié)構(gòu)。
　　2.利用Genevestigator數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)，對(duì)水稻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出了9個(gè)和逆境脅迫（低溫、干旱、高鹽）相關(guān)的候選基因。進(jìn)一步利用熒光定量 PCR方法對(duì)9個(gè)候選基因的逆境誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2個(gè)基因OsPHD14和 OsPHD30同時(shí)對(duì)3種脅迫處理均有一定程度的響應(yīng)，低溫脅迫

5、下有2個(gè)基因OsPHD13和OsPHD52表達(dá)上調(diào)顯著，至少15倍；在干旱和高鹽脅迫下，候選基因上調(diào)表達(dá)的都不太顯著。
　　3.分別克隆了受低溫誘導(dǎo)基因OsPHD13和OsPHD52的上游5’端1Kb的調(diào)控序列，作為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因構(gòu)建表達(dá)載體，導(dǎo)入農(nóng)桿菌后進(jìn)行水稻遺傳轉(zhuǎn)化?；瘜W(xué)染色結(jié)果顯示，低溫誘導(dǎo)處理后，pOsPHD13和pOsPHD52啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉都有不同程度的表達(dá)活性，且在莖部的活

6、性比其他組織部位更強(qiáng)，說(shuō)明啟動(dòng)子pOsPHD13和pOsPHD52的確具有低溫誘導(dǎo)活性。
　　4.進(jìn)一步對(duì)啟動(dòng)子pOsPHD13和pOsPHD52進(jìn)行了功能分析，通過(guò)順式作用元件的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、啟動(dòng)子截?cái)嗳笔Х治?、功能獲得分析及元件突變分析等研究，在煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，獲得了啟動(dòng)子pOsPHD13和pOsPHD52低溫誘導(dǎo)功能的關(guān)鍵序列，分別位于pOsPHD13啟動(dòng)子的（-856bp~-817bp）區(qū)段和pOsPHD52啟動(dòng)子的

7、（-295bp~-224bp）區(qū)段。生物信息學(xué)結(jié)果提示，在這2段關(guān)鍵序列中，各有1個(gè)響應(yīng)低溫脅迫的DRE/CRT順式作用元件。對(duì)元件進(jìn)行點(diǎn)突變和全突變分析后發(fā)現(xiàn)，該元件的確在pOsPHD13和pOsPHD52啟動(dòng)子中承擔(dān)著響應(yīng)低溫的功能。
　　5. CBF轉(zhuǎn)錄因子能特異性識(shí)別結(jié)合DRE/CRT順式作用元件，該家族有4個(gè)成員蛋白。采用酵母單雜技術(shù)和EMSA試驗(yàn)，鑒定了與啟動(dòng)子中DRE/CRT順式作用元件結(jié)合互作的反式作用因子。結(jié)果表