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1、血管生長抑制因子 kringle 5 是目前發(fā)現(xiàn)的抑制血管增生活性最強(qiáng)的溶酶原片段,可有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。它具有高效、高細(xì)胞選擇性以及短的氨基酸序列的特點(diǎn),這使它具有治療血管增生性疾病的潛在臨床應(yīng)用價值。 本研究在構(gòu)建融合型血管生長抑制因子kringle 5原核表達(dá)系統(tǒng)及工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究基礎(chǔ)上,開始rK5蛋白分離純化工藝的探索研究。先后采用了中性鹽沉淀法(包括氯化鈉和硫酸銨的分級沉淀)、等電點(diǎn)沉淀法、柱色譜法等
2、多種不同的分離純化工藝,反復(fù)試驗、逐步篩選,最后建立了兩步柱色譜法分離純化重組kringle 5的新工藝。 兩步柱色譜法分離純化重組血管生長抑制因子kringle 5的工藝主要包括:Ni<'2+>螯合的 Chelating Sepharose Fast Flow 親合柱色譜和Sephadex G-75凝膠排阻柱色譜。其中Ni<'2+>螯合的 Chelating Sepharose Fast Flow親和色譜柱規(guī)格為20×1.0
3、cm i.d.,流動相 A 為20 mmol/L PBS+0.5 mol/L NaCl (pH 7.4)溶液,流動相B為20 mmol/L PBS+0.5 mol/L NaCl+0.5 mol/L 咪唑 (pH 7.4)溶液,采用等度+梯度的方式洗脫,洗脫流速為2.0 mL/min。Sepharose G-75凝膠排阻色譜柱規(guī)格為100×1.5 cm i.d.,流動相為10 mmol/L PBS+0.15 mol/L NaCl (pH
4、7.4)溶液,采用等度方式洗脫,洗脫流速為1.0 mL/min。研究發(fā)現(xiàn)采用此工藝后,經(jīng)第一步親和柱色譜分離得到的目的蛋白用變性聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分析,其純度約為80%,蛋白得率約為1.92%;再經(jīng)第二步凝膠柱色譜分離后得到目的蛋白純度約為96%,蛋白總得率約為0.63%。最后,采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)法對得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行生物活性分析,結(jié)果表明純化產(chǎn)物對雞胚絨毛尿囊膜血管生長抑制作用明顯。 研究結(jié)果表明,兩
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