甘藍型油菜及其親本物種TT12基因家族的克隆與比較基因組學研究.pdf

1、十字花科中，擬南芥（Arabidopsis thaliana）是重要的模式植物，蕓薹屬含有多種重要的油料、蔬菜和觀賞園藝植物。蕓薹屬內部的物種間以及蕓薹屬與擬南芥之間的比較基因組學研究，是理論研究一個熱點，也是將擬南芥模式植物中功能基因的重要研究成果應用到蕓薹屬作物進行遺傳改良的有力工具。甘藍型油菜（Brassica napus）是由甘藍（B．oleracea）和白菜型油菜（B．rapa）融合而成的異源四倍體。比較基因組學發(fā)現(xiàn)，蕓薹屬基

2、本種在進化中相對于擬南芥發(fā)生了基因組水平的三倍化，并伴隨發(fā)生了局部區(qū)段的丟失、再加倍和重排。目前的比較基因組學研究多集中于通過分子標記手段，從宏觀上揭示物種間在基因組和染色體水平的共線性程度，而基于功能基因比較克隆的比較基因組學和比較生物學研究對于油菜等蕓薹屬作物具有重要的理論和現(xiàn)實意義。 黃籽性狀具有綜合品質優(yōu)勢和良好的市場前景，是世界油菜研究中的一個熱點和難點。白菜型油菜和甘藍中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但甘藍型油菜卻

3、沒有，而通過遠緣雜交等方法創(chuàng)造黃籽材料的選育周期長、效率低，尤其是黃籽表型易受環(huán)境影響而不穩(wěn)定。當前急需對甘藍型油菜和其親本物種中與黃籽性狀相關的重要功能基因進行全長序列的比較克隆，然后進行比較基因組學和比較生物學研究，揭示這3個物種間在黃籽性狀上的分子遺傳學機理，并通過基因工程改良甘藍型油菜的籽色性狀。 擬南芥等植物中種皮色素的主要成分是原花青素單體的聚合物，是由苯丙烷－類黃酮途徑形成的。該途徑的眾多功能基因中，擬南芥TT12

4、基因（AtTT12）在種皮中特異表達，編碼一種類多藥轉運蛋白，負責種皮色素向液泡的轉運，其單基因失活突變即可導致由野生型的深褐色種子轉變?yōu)橥该鞣N皮（黃籽）。油菜與擬南芥同屬十字花科，種皮色澤等性狀也相似，因此本研究克隆了甘藍型油菜和其親本物種中TT12基因的全長序列，進行了比較基因組學分析。 1）率先克隆了甘藍型油菜及其2個親本物種的TT12基因（家族） 本研究采用cDNA末端快速擴增技術，率先克隆了甘藍型油菜及其親本物

5、種白菜型油菜和甘藍中TT12基因（家族）的全長cDNA和基因組序列。甘藍型油菜BnTT12—1基因全長2712bp，mRNA全長1747bp（不計polyA尾巴，下同）：BnTT12—2基因全長3000bp，mRNA全長1678bp；白菜型油菜BrTT12基因全長2711bp，mRNA全長1747bp；甘藍BoTT12基因全長3062bp，mRNA全長1739bp。該結果為深入研究蕓薹屬TT12基因的功能、進化、調控模式奠定了基礎，也為

6、通過對TT12基因的轉基因表達抑制（反義、RNA干擾）或TILLING突變體篩選來創(chuàng)造新型黃籽油菜新材料奠定了基礎。 2） BnTT12—1、BnTT12—2、BrTT12和BoTT12符合TT12基因的典型特征 它們的基因組序列都有7個內含子，位置都與AtTT12的一致，都符合GT...AG的內含子剪切位點邊界序列特征。在BnTT12—1、BnTT12—2、BrTT12和BoTT12 mRNA的62-1585、17—1

7、540、60—1583和78—1601bp處都有一個1524bp的ORF（含終止密碼子，下同），5'UTR分別為61、16、59和77bp，3'UTR分別為162、138、164和138bp。它們的polyA加尾信號AAATAAA分別位于最末polyA加尾位點上游間隔96、83、98和83bp處。 與AtTT12相似，推導的BnTT12—1、BnTT12—2、BrTT12和BoTT12蛋白均為507 aa。BnTT12—1的計算

8、分子量Mw=55．080 kDa，等電點pI=3．24； BnTT12—2的Mw=55．168 kDa，pI=3．24； BrTT12的Mw=55．199 kDa，pI=4．24； BoTT12的Mw=55．128 kDa，pI=3．24。它們是典型的酸性蛋白。它們均以亮氨酸含量最高（15．11％）。BnTT12—1、BnTT12—2和BoTT12有21個潛在的磷酸化位點，BrTT12則有19個，所以磷酸化可能參與它們的蛋白活性調節(jié)。預

9、測它們沒有信號肽或信號錨定，很可能定位于質膜，而且都有9個可能的跨膜區(qū)，這與跨膜轉運蛋白AtTT12相似。 它們的二級結構非常相似，均以α螺旋為主（64．6g％、62．52％、64．8g％、64．10％），其次是隨機卷曲（20．71％、21．10％、19．72％、18．93％）。整個分子平均分布大量的α—螺旋，但其中在蛋白的中部偏N末端、偏C末端以及C末端，都有較大的α－螺旋，同時還有一些小的α－螺旋分散在整個分子中，而延伸鏈、

10、β－轉角和隨機卷曲的分布則相對較為均勻，這與TT12等MATE家族跨膜轉運蛋白的基本特征一致。未能預測出它們蛋白質的三級結構。 核苷酸序列和氨基酸序列的BLAST分析、序列兩兩比對和多重比對、序列的系統(tǒng)發(fā)生分析均表明，它們與AtTT12有最高的相似性。從基因結構、蛋白結構、序列同源性三大方面分析，均顯示它們是AtTT12的垂直同源基因，具有TT12的典型特征。 3）蕓薹屬基本種中TT12基因數(shù)與擬南芥相比并沒有發(fā)生三倍化

11、 本研究通過竭盡式克隆，從甘藍型油菜、白菜型油菜和甘藍中分別只克隆到了2條、1條和1條TT12基因。Southern blot雜交結果所指示的同源拷貝數(shù)與基因家族成員數(shù)的序列結構非常吻合。因此，蕓薹族的公共祖先與擬南芥分開后在TT12位點上很可能并沒發(fā)生基因數(shù)目的三倍化，或者在基因加倍后不久隨即發(fā)生了多數(shù)成員的丟失，從而使蕓薹屬二倍體基本種中只有1條TT12基因。 4）白菜型油菜和甘藍確實為甘藍型油菜的供體親本

12、 BnTT12-1和BrTT12之間基因組序列的一致性達到96．5％，BnTT12—2和BoTT12之間達到99．4％，遠遠高于甘藍型油菜種內成員BnTT12—1與BnTT12—2之間的一致性，氨基酸水平上的趨勢也是如此。核酸水平和氨基酸水平的系統(tǒng)發(fā)生聚類顯示，BnTT12—1和BrTT12更緊密，BnTT12—2則和BoTT12更緊密。此外，從內含子的一致性、5'UTR中的oligo A的位置與長度、基因序列中的特征性變異堿基、氨基酸

13、序列中的特征性交異氨基酸等方面來看，都表明BnTT12—1對應于BrTT12，BnTT12—2對應于BoTT12，說明甘藍和白菜型油菜的確為甘藍型油菜提供了遺傳物質。本研究從功能基因家族成員的全長序列比較克隆的角度，為揭示甘藍型油菜與其親本物種間的進化關系提供了直觀而具體的分子證據(jù)。 5）揭示了TT12基因的一些新的結構特征 蕓薹屬4個TT12基因的5'UTR中均存在轉錄起始位點的多態(tài)性，BnTT12—1中為A1、A6，

14、BnTT12—2中為A1、 A2，BrTT12中為A1、G3，BoTT12中為A1、A5、A30、 A35、G59。它們的3' UTR中也都存在加尾位點的多態(tài)性，BnTT12—1中為C2627、T2631、C2694、T2712，BnTT12—2中為T2929、C2939、 C3000，BrTT12中為C2624、C2688、C2691、T2711，BoTT12中為T2994、T3040、C3062。它們也許代表了一種順式調控方式，也許

15、只是轉錄起始和poy A加尾過程中的允許誤差。 ATG上游的oligoA結構是十字花科TT12基因的一個保守性基序。BnTT12—1中為22bp，與ATG間隔7bp； BnTT12—2中為10bp，與ATG間隔6bp，BrTT12中為25bp，與ATG間隔7bp，BoTT12中為10bp，與ATG間隔6bp，AtTT12中為10bp，與ATG間隔21bp。這種oligo A結構有可能在mRNA翻譯時有助于核糖體的特異識別與結合