甘藍型油菜硫苷轉運基因BnGTRs的克隆與初步研究.pdf

1、油菜是我國主要油料作物之一。油菜籽榨油后的餅粕是良好的禽畜類動物蛋白飼料。然而餅粕中含有較多硫苷及水解產(chǎn)物，會對牲畜產(chǎn)生毒害作用。另一方面，硫苷及其水解產(chǎn)物是植物防御體系中的重要物質，其含量的高低能影響植物抗蟲抗病性。運用傳統(tǒng)育種方法培育的低硫苷油菜材料，其葉片莖稈硫苷含量伴隨著種子硫苷含量的減少而減少，導致抗蟲抗病性的降低，影響了低硫苷低芥酸油菜的推廣。因此通過控制硫苷在油菜不同組織中的分配獲得葉片等營養(yǎng)器官硫苷含量高而籽粒中硫苷含量

2、低的材料，具有重要的現(xiàn)實意義。本研究分析了不同甘藍型油菜材料硫苷種類和含量差異，并依據(jù)前人對擬南芥硫苷轉運子基因AtGTRs的研究，利用GENE RACE方法克隆了甘藍型油菜中的BnGTRs基因，并通過amiRNA敲除技術獲得轉基因T0代，通過考察T0代植株中BnGTRs的表達和葉片硫苷含量，初步探討了BnGTRs的功能。主要結果如下:
　　1.高硫、中硫、低硫材料中葉片硫苷和籽粒硫苷含量的差異分析
　　高硫、中硫和低硫材料

3、葉片總硫苷的差異在于脂肪族硫苷，主要是2-羥基-3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷的含量差異，吲哚族硫苷的差異不明顯。
　　在籽粒硫苷的比較中，高硫、中硫和低硫材料總硫苷含量的差異主要是脂肪族硫苷——2-羥基-3-丁烯基脫硫硫苷，吲哚族硫苷的差異不明顯。
　　2.BnGTRs基因的克隆和結構特征
　　采用同源克隆法，利用GENE RACE技術，在甘藍型油菜中克隆分離了2個硫苷轉運子基因BnGTR1和BnGTR2。兩個基因O

4、RF均為1839bp，編碼612個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子分別為TGA和TAA，序列一致性為90％。進化樹分析結果顯示，BnGTRs為擬南芥AtGTR2基因的同源序列。與AtGTRs相似，BnGTRs均含有PTR跨膜結構域，后經(jīng)GFP熒光亞細胞定位實驗證實可能定位在質膜上。這些結果初步說明BnGTRs可能為硫苷轉運子。
　　3.BnGTRs的功能分析
　　利用amiRNA技術構建表達載體轉化受體材料得到轉基因T

5、0代，對T0代植株葉片進行Realtime-PCR分析，發(fā)現(xiàn)在amiRNA特異沉默下，BnG TR2下調表達，而BnGTR1則沒有類似的規(guī)律，說明amiRNA主要對BnGTR2表達有影響。對T0代植株葉片硫苷含量進行高效液相色譜測定發(fā)現(xiàn)，與陰性對照相比，總硫苷含量顯著降低，其中脂肪族硫苷含量顯著減少，而吲哚族硫苷含量無明變化。
　　根據(jù)上述實驗結果推測，在BnGTRs的兩個同源序列中，BnGTR2與硫苷的轉運相關，而BnGTR1與