HSR對燒傷血清誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α、HMGB1和IL-10基因表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制.pdf

1、第一章燒傷血清誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞系RAW264.7釋放TNF-α、HMGB1及IL-10的規(guī)律及意義 目的：從細(xì)胞水平探討燒傷血清處理的RAW264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α、HMGB1、IL-10的規(guī)律及意義。 方法：制備嚴(yán)重?zé)齻笫竽Ｐ瞳@取燒傷大鼠血清；采用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，分別以燒傷大鼠血清處理制備細(xì)胞模型；細(xì)胞隨機(jī)分為兩組：(1)正常血清處理組(2)燒傷血清處理組。兩組的劑量效應(yīng)分別用含有體積分?jǐn)?shù)0％

2、、5％、10％、20％的正常血清及燒傷血清的培養(yǎng)基與RAW264.7細(xì)胞系共培養(yǎng)24h，分別收取燒傷血清刺激組及對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清，3500 g離心后留取上清于-20℃保存?zhèn)溆谩山M的時(shí)間效應(yīng)分別以含有體積分?jǐn)?shù)20％的正常血清及燒傷血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞0h，4h，12h，24h，同上留取離心后的培養(yǎng)液上清。以上每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用雙抗體夾心ELISA法測定RAW264.7培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-10含量，Weste

3、rn blot分析RAW264.7細(xì)胞HMGB1的含量。 結(jié)論：燒傷血清能以時(shí)間和劑量依賴方式誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7的TNF-α的分泌增加，以時(shí)間依賴方式誘導(dǎo)HMGB1和IL-10的分泌增加。 第二章熱休克反應(yīng)對燒傷大鼠的保護(hù)作用及對燒傷血清誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α，IL-10及HMGBl的影響 目的：探討HSR對燒傷大鼠的保護(hù)作用及對燒傷血清誘導(dǎo)的TNF-α、IL-10和HMGB1的影響。

4、 方法：制備燒傷大鼠模型，觀察72h內(nèi)死亡率；傷后6h取各組動(dòng)物血清觀測各項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)，一部分大鼠于HSR(42℃，15min，室溫下恢復(fù)24h)后再進(jìn)行燒傷，24h后摘取肝、肺組織行病理切片檢查。將傳代RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為三組：(1)正常血清處理組。(2)燒傷血清處理組。 (3)熱休克預(yù)處理后燒傷血清處理組：熱休克(HSR)處理：將細(xì)胞置于42℃的水浴箱中熱休克1 h，然后在37℃恢復(fù)12 h，然后加入燒傷血清處理。三組的劑

5、量效應(yīng)分別用含有體積分?jǐn)?shù)0％、5％、10％、20％的正常血清及燒傷血清的培養(yǎng)基與小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7共培養(yǎng)24h，分別收取燒傷血清刺激組及對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清，3500 g離心后留取上清備用。三組的時(shí)間效應(yīng)分別以含有體積分?jǐn)?shù)20％的正常血清及燒傷血清的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞0 h，4 h，12 h，24h，同上留取離心后的培養(yǎng)液上清，以上每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用雙抗體夾心ELISA法測定RAW264.7培養(yǎng)上清中TN

6、F-α和IL-10含量，Western blot分析HMGB1的含量，RT-PCR檢測TNF-α mRNA的表達(dá)、IL-10 mRNA的表達(dá)。 結(jié)論：HSR抑制燒傷血清誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1釋放和TNF-α mRNA的表達(dá)；HSR上調(diào)燒傷血清誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-10mRNA的表達(dá)。 第三章 HSF1過表達(dá)對RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-a，IL-10及HMGB1基因表達(dá)的影響 目的：探

7、討熱休克因子1(heat shock factor1，HSF1)過表達(dá)對燒傷血清處理的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)TNF-α、高遷移率族蛋白-1(HMGB1)、IL-10基因表達(dá)的影響。 方法：制備嚴(yán)重?zé)齻笫竽Ｐ?，獲取燒傷大鼠血清；構(gòu)建HSF1基因的真核表達(dá)載體，繼而將HSF1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSF1的巨噬細(xì)胞株，最后將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)燒傷血清處理，探討HSF1過表達(dá)對燒傷血清處理的RAW264.7巨噬細(xì)

8、胞TNF-a，HMGB1和IL-10基因表達(dá)的影響。 結(jié)論：HSF1過表達(dá)可以抑制燒傷血清誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-a mRNA和HMGBlmRNA的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)IL-10 mRNA的表達(dá)。 第四章 HSF1對IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 目的：探討HSF1對IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。 方法：合成IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)含HSE位點(diǎn)的寡核苷酸探針進(jìn)行凝膠滯留實(shí)驗(yàn)(EMSA)，分析HSF1與IL-1