CXCR4表達在衰老骨髓細胞中的變化及其對血管再生功能的影響.pdf

1、實驗背景：
　　 隨著社會經濟的發(fā)展，心腦血管疾病的發(fā)病率日益增高。動脈閉塞作為冠心病、腦血管意外和下肢缺血的共同病因，其發(fā)病率在老年人群中漸增。利用人體自身的細胞來生成新血管的細胞替代治療作為一種低成本、低風險的治療方案已越來越受重視。不幸的是，可能從中受益最大的老年患者體內可用的祖細胞數(shù)量及其血管生成能力均已極度衰減。
　　 骨髓源性干細胞(BMCs)具有多向分化能力，并能提供支持血管生長和成熟的蛋白質，從而促進新生

2、血管生成。基質細胞衍生因子-1(SDF-1)是動員骨髓細胞和促進細胞向靶組織歸巢的過程中的關鍵性趨化因子。SDF-1通過與靶細胞表面受體CXCR4結合并激活CXCR4而起作用。不同類型的細胞表面CXCR4的表達各不相同，而通過適當?shù)捏w外培養(yǎng)可以增加其表達。我們過去的研究表明，鈣處理可提高對骨髓細胞表面CXCR4的表達。BMCs表面CXCR4的表達水平決定了細胞向靶組織歸巢及隨后血管生成的效率。MSCs或CD34+細胞CXCR4的過度表達

3、，在體外實驗中會增強這些細胞向SDF-1的遷移，在體內實驗中則能增加骨髓移植的療效，這些都很可能歸功于細胞存活和歸巢的增加。但是，老年人骨髓中所含有的干細胞祖細胞在治療和修復功能方面有所缺陷。無論動物或人類，其EPC水平和功能均因衰老、糖尿病、缺血性心臟病和動脈粥樣硬化而受到不利影響，血管生成功能也因衰老而受損，然而這些因素在分子層面的影響尚不明確。
　　 實驗目的：
　　 研究骨髓細胞CXCR4表達是否因衰老而有所缺陷

4、，從而使骨髓中CXCR4+祖細胞的數(shù)量減少，并進一步導致骨髓細胞向缺血組織的歸巢能力及促血管新生能力的受損。并對可能的機制進行探討。
　　 實驗方法：
　　 應用流式細胞術檢測全骨髓細胞表面及細胞內CXCR4的表達，分別根據(jù)骨髓細胞表面抗原的不同和細胞大小的不同對其進行分群，并對不同細胞亞群表面CXCR4的表達進行檢測；應用real-time PCR技術檢測CXCR4的mRNA表達；從基因轉錄、蛋白表達及蛋白內移能力等不

5、同水平、不同細胞亞群研究衰老對CXCR4表面表達的影響。通過1mM氯化鈣作為細胞外刺激因子短期處理骨髓細胞，研究BMCold CXCR4對細胞外刺激因子的反應是否與BMCyoung有所區(qū)別。通過測定骨髓細胞與氯化鈣混合后細胞內鈣離子濃度的升高對鈣離子內流進行分析，研究衰老對細胞鈣內流的影響，從而解釋衰老細胞CXCR4對鈣刺激不敏感的原因。應用Western Blot技術檢測SDF-1/CXCR4的下游信號通路AKT和ERK1/2的磷酸化

6、水平，以研究衰老對SDF-1/CXCR4的下游信號通路的影響。應用改進的Boyden小室法檢測BMC的遷移能力；又以細胞粘附試驗檢測SDF-1介導的BMC向HUVEC單細胞層的粘附能力，以垂直膠原凝膠侵襲試驗檢測骨髓細胞穿越內皮細胞的遷移能力，從而在體外模擬CXCR4+的BMCs在體內先被SDF-1捕獲，緊密粘附于血管內皮細胞表面，再完成跨內皮細胞遷移至受損組織的過程；建立小鼠后肢缺血模型，經尾靜脈注射輸入骨髓細胞，再分別通過免疫組化和

7、激光多普勒灌注成像術(LDPI)檢測在缺血組織內不同骨髓細胞的增殖、歸巢和血管生成，從而研究衰老引起CXCR4表達受損是否進一步影響細胞的功能。通過骨髓細胞移植對接受致死量的放射線照射后的骨髓重建研究年輕和老年微環(huán)境對骨髓細胞CXCR4表達的影響。
　　 實驗結果：
　　 小鼠后肢缺血模型中老年小鼠在2和3周時缺血肢體灌注的恢復明顯低于年輕小鼠，并且SDF-1治療也沒有提高灌注量。相較于年輕小鼠，老年小鼠中向缺血部位歸巢

8、的祖細胞更少，且對SDF-1處理更不敏感，導致其血管新生反應受損。
　　 通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，BMCold表面表達CXCR4的細胞數(shù)量更少，且每一個細胞表面的CXCR4表達更少。鈣離子處理可以增強BMCyoung中CXCR4的表達，但老年小鼠細胞表面CXCR4的表達卻對鈣離子的刺激并不敏感。而其原因可能是BMCold的鈣內流缺陷使CXCR4基因轉錄水平降低，從而導致鈣誘導CXCR4表達反應受損。在不同的BMC亞群中，除了BM

9、Cyoung中的Lin-細胞明顯多于BMCold外，其余亞群細胞量在BMCyoung和BMCold間沒有顯著差異。Lin-Sca-1+亞群表面CXCR4的表達，年輕小鼠顯著高于老年小鼠，而兩者之間CD34+Flk1+亞群、Gr-1+CD11b+亞組的CXCR4表達沒有顯著差異。而根據(jù)細胞大小對BMC進行分組后，“小細胞”亞群總是具有更高的表面CXCR4表達量。鈣處理所致亞群CXCR4表達的增長在BMCold亞群中也明顯要少很多。

10、　　 SDF-1與其受體CXCR4的結合會使CXCR4向細胞內移位。BMCold CXCR4的這種內移反應正常，其與BMCyoung的主要區(qū)別在于基礎CXCR4表達的降低及其對鈣處理應答的缺乏。在SDF-1/CXCR4的下游信號通路的反應方面，BMCyoung對鈣刺激提高細胞內通過SDF-1/CXCR4相互作用的信號通路活性更為敏感，而BMCold中SDF-1/Akt通路受到了抑制。另一方面，ERK1/2信號轉導通路則未發(fā)生改變。

11、r>　　 在體外試驗中，BMCold的粘附能力、向SDF-1的遷移能力和跨內皮細胞的侵襲能力均受損。而通過相互的骨髓細胞移植發(fā)現(xiàn)，體內微環(huán)境的改變并不能改變骨髓細胞CXCR4表達和對SDF-1的遷移能力。在體內試驗中，由SDF-1介導的BMCold向缺血肌肉歸巢的能力受損，血管生成能力受損，且不因鈣處理而提高。
　　 實驗結論：
　　 相較于BMCyoung，BMCold：(1)表面CXCR4表達及細胞內CXCR4的濃

12、度均降低了；(2)對細胞外輔助劑如鈣對細胞表面CXCR4表達的刺激的敏感性降低；(3)明顯降低的鈣內流和鈣刺激不能使CXCR4 mRNA表達量增加；(4)SDF-1介導的CXCR4內移對鈣刺激的反應極大地減少；(5)相應于SDF-1處理的Akt磷酸化幾乎完全受抑。
　　 而衰老對骨髓細胞CXCR4表達的這些影響也轉化成了以下的功能障礙：(1)骨髓細胞未能向SDF-1濃度梯度遷移；(2)鈣不能加強這方面的遷移能力；(3)骨髓細胞在