疫霉菌激發(fā)子parasiticein誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡及發(fā)生機制研究.pdf

1、過敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)和壞死(necrosis)是植物．病原物互作最常見的兩種現(xiàn)象。一般認(rèn)為，壞死是由于植物受病原物侵染引起的機械損傷或因某些毒性因子毒害而造成的病理性的細(xì)胞死亡，而HR．是一種程序化死亡(programmed cell death，PCD)，是寄主植物應(yīng)對病原物侵染的主動的抗病反應(yīng)，受寄主內(nèi)在基因的調(diào)控，因此HR與壞死在發(fā)生機制及細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)上，都有著本質(zhì)的區(qū)別。研究兩

2、種死亡的發(fā)生機制對正確理解植物．病原物的互作關(guān)系具有重要的指導(dǎo)意義。 Elicitins是疫霉屬(Phytophthora)和腐霉屬(Pythium)植物病原卵菌產(chǎn)生的、能在煙草上引起過敏性反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性(Systemic acquiredresistance，SAR)的胞外蛋白質(zhì)的總稱。Elicitins有α型(酸性)和β型(堿性)，寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)產(chǎn)生的Elicit洫為α型，稱為p

3、arasiticein。本實驗室已從煙草黑脛病菌(P.parasiticai)中克隆了編碼parasiticein的基因并體外表達(dá)了該蛋白，本文以parasiticein和煙草懸浮細(xì)胞為互作體系，探討了其誘導(dǎo)煙草細(xì)胞死亡的形態(tài)及生化特征、分析了細(xì)胞死亡的發(fā)生機制，得到以下幾方面的研究結(jié)果： 1．建立了煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，分析了懸浮細(xì)胞的最佳保存方法獲得細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、分散程度較高、生長速度較快的懸浮細(xì)胞系是本研究的基礎(chǔ)。

4、 首先，通過分析不同培養(yǎng)溫度、激素配比、轉(zhuǎn)速、碳源和初始轉(zhuǎn)接量對煙草懸浮細(xì)胞生長的影響等，得到煙草懸浮細(xì)胞最佳培養(yǎng)條件為，MS培養(yǎng)基+6-BA 0.2 mg/L+NAA 2.0 mg/L，愈傷轉(zhuǎn)接量為5％，蔗糖濃度3％，振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)溫度26℃，在此條件下培養(yǎng)10d可使細(xì)胞干重達(dá)到46.2 g/L。 第二，液體振蕩培養(yǎng)保存懸浮細(xì)胞不僅存在易污染、需經(jīng)常繼代等弊端，而且受實驗室條件的限制，因此，正確保存懸浮細(xì)胞是

5、本研究能否繼續(xù)的保障。將液體培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞返回固體培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷化保存，發(fā)現(xiàn)保存后的細(xì)胞所形成的愈傷組織潔白、疏松、有更強的生活力。將其再進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)時，細(xì)胞從愈傷組織到形成分散性好的懸浮細(xì)胞的過渡期明顯縮短，比直接用愈傷組織重新培養(yǎng)可縮短20-30d。此外，該方法細(xì)胞存活期長，一般可保存60-75d，并且保存溫度范圍大，從15℃-30℃都可保存。 2．Parasiticein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡表現(xiàn)凋亡的典型形態(tài)及生化特征細(xì)胞凋亡是

6、一種程序化反應(yīng)，表現(xiàn)許多形態(tài)及生化特征，包括原生質(zhì)膜收縮、染色質(zhì)濃縮、基因組DNA斷裂形成梯狀片斷等。為了解parasiticein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡是否具有凋亡的特征，從以下幾方面進(jìn)行了研究。 2.1 用濃度約100nmol/L的parasiticein處理煙草細(xì)胞后，相差顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)煙草細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞膜收縮，與細(xì)胞壁間形成空隙和原生質(zhì)濃縮等；用trypan blue染色后觀察，也可發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象； 2.2 對誘導(dǎo)處

7、理的懸浮細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后，熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核先后表現(xiàn)染色質(zhì)凝集、形成顆粒狀物等特征； 2.3 對處理細(xì)胞用透射電鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)處理細(xì)胞不僅表現(xiàn)染色質(zhì)裂解、液泡膜破裂，還發(fā)現(xiàn)核仁降解成小的片斷，并形成類凋亡小體的結(jié)構(gòu)等細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)特征； 2.4 對處理的懸浮細(xì)胞提取基因組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在瓊膠電泳上出現(xiàn)約360bp-900bp及150-300bp大小的清晰的梯狀排列的片斷。 上述結(jié)果

8、表明，parasiticein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡具有細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)及生化特征，是一種程序化的死亡。 3. Parasiticein誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡的機制細(xì)胞凋亡作為一種主動反應(yīng)，有多種信號通路的參與，包括活性氧積累、蛋白激酶信號通路的調(diào)節(jié)等。為檢測parasiticein誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否具有類似的反應(yīng)，從以下幾方面進(jìn)行了分析： 3.1 用熒光探針DCFH-DA對parasiticein處理的煙草細(xì)胞在熒光顯微鏡下進(jìn)

9、行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在處理的4-8h，細(xì)胞呈現(xiàn)較強的綠色熒光，表明胞內(nèi)產(chǎn)生了大量的活性氧,10h后，綠色熒光開始減弱，表明此時活性氧含量開始下降。進(jìn)一步對處理細(xì)胞的：H<,2>O<,2>進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)H<,2>O<,2>的積累表現(xiàn)類似的趨勢，第一個峰出現(xiàn)在處理后4h，第二個峰出現(xiàn)在處理后8h，且第二個峰值大于第一個峰值，說明H<,2>O<,2>可能是活性氧的主要形式。 3.2 對處理細(xì)胞的活性氧代謝相關(guān)酶進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)SOD、POD和

10、CAT等的活性在誘導(dǎo)處理后均有不同程度的變化，表明它們在活性氧代謝過程中可能發(fā)揮不同的作用； 3.3 為明確氧化反應(yīng)在煙草細(xì)胞死亡中的作用，進(jìn)一步用抗氧化劑抗壞血酸鹽對parasitieein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)oarasiticein可使細(xì)胞發(fā)生凋亡的時間延緩15-20小時，此外，抗壞血酸鹽對parasitieein誘導(dǎo)的SOD、POD和CAT等酶的活性也有不同程度影響，這些結(jié)果進(jìn)一步表明，活性氧是paras

11、ificein誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡的重要因子。 3.4 用蛋白激酶抑制劑K252-a對parasiticein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡分析發(fā)現(xiàn)，parasiticein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡可被K252-a所部分抑制，表明oarasificein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡，受蛋白激酶信號通路的調(diào)控。 4．總結(jié) 綜合以上結(jié)果我們認(rèn)為，parasiticein誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡不僅表現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)和生化特征，而且有不同信號通路的參與