三種激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡調(diào)控基因的克隆及其功能分析.pdf

1、植物病原菌產(chǎn)生的激發(fā)子是一類重要的信號(hào)分子，能模仿植物與病原菌的信號(hào)交流，引起過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)和氣孔關(guān)閉，誘發(fā)植物的抗病性。本研究采用病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus inducing gene silencing，VIGS)技術(shù)克隆了本氏煙(Nicotiana benthamiana)中受不同來(lái)源激發(fā)子(Nepl、harpin和INF1)誘導(dǎo)的調(diào)控過(guò)敏性細(xì)胞死亡的基因，并對(duì)其中一

2、個(gè)調(diào)控過(guò)敏性細(xì)胞死亡的基因NbALY916進(jìn)行了系統(tǒng)的功能研究。
　　 以農(nóng)桿菌Gv3101為宿主、利用PVX病毒表達(dá)載體構(gòu)建了含有7000個(gè)單克隆的本氏煙cDNA文庫(kù)，采用牙簽刺傷法和注射接種法，從6000個(gè)克隆中篩選到35個(gè)受不同激發(fā)子誘導(dǎo)的調(diào)控過(guò)敏性細(xì)胞死亡的基因（片段）。對(duì)上述陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)其中14個(gè)與已知的基因具有較高的同源性，其中克隆Nb14-4編碼一個(gè)特異的ALY蛋白；克隆Nb14-56編碼普通煙

3、中的一種捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白；克隆Nb38(2)-59編碼一個(gè)核糖核蛋白R(shí)NP-1；克隆Nb3-9和Nb4-26分別編碼一個(gè)蘋果酸脫氫酶和果糖二磷酸醛縮酶；Nb4-28編碼普通煙中的14-3-3d-2蛋白。還有21個(gè)克隆在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源基因，提示可能是因克隆到的片段過(guò)小或數(shù)據(jù)庫(kù)中本氏煙EST序列不全造成的。上述結(jié)果表明，利用病毒表達(dá)載體建立cDNA文庫(kù)，采用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)可從煙草全基因組內(nèi)克隆受不同激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞

4、死亡的調(diào)控基因，為揭示植物過(guò)敏性細(xì)胞死亡分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　 從本氏煙cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)調(diào)控過(guò)敏性細(xì)胞死亡的基因NbALY916，該基因沉默能抑制Nepl誘導(dǎo)的HCD，減緩harpin誘導(dǎo)的HCD，但不影響INF1誘導(dǎo)的HCD;而本氏煙中其它的三個(gè)ALY基因（NbALY615、NbALY617和NbALY1693）分別沉默后不影響3種激發(fā)子誘導(dǎo)的HCD，表明NbALY916在調(diào)控激發(fā)子誘導(dǎo)的HCD過(guò)程中具有特異性。

5、NbALY916基因沉默削弱了激發(fā)子Nepl和harpin誘發(fā)的H2O2積累、抑制了它們誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細(xì)胞中NO的積累，但是對(duì)激發(fā)子INF1信號(hào)途徑卻沒(méi)有影響，同時(shí)不影響3種激發(fā)子誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累.表明NbALY916在不同激發(fā)子誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉及NO和H2O2積累中作用存在差異。與此同時(shí)，NbALY916沉默能抑制激酶MAPKKKα過(guò)表達(dá)所誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡，抑制轉(zhuǎn)錄因子WRKY2的表達(dá)，但不影響MAPKKKα、MEK