三種激發(fā)子誘導(dǎo)的過敏性細(xì)胞死亡調(diào)控基因的克隆及其功能分析.pdf

1、植物病原菌產(chǎn)生的激發(fā)子是一類重要的信號分子，能模仿植物與病原菌的信號交流，引起過敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)和氣孔關(guān)閉，誘發(fā)植物的抗病性。本研究采用病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus inducing gene silencing，VIGS)技術(shù)克隆了本氏煙(Nicotiana benthamiana)中受不同來源激發(fā)子(Nepl、harpin和INF1)誘導(dǎo)的調(diào)控過敏性細(xì)胞死亡的基因，并對其中一

2、個調(diào)控過敏性細(xì)胞死亡的基因NbALY916進(jìn)行了系統(tǒng)的功能研究。
　　 以農(nóng)桿菌Gv3101為宿主、利用PVX病毒表達(dá)載體構(gòu)建了含有7000個單克隆的本氏煙cDNA文庫，采用牙簽刺傷法和注射接種法，從6000個克隆中篩選到35個受不同激發(fā)子誘導(dǎo)的調(diào)控過敏性細(xì)胞死亡的基因（片段）。對上述陽性克隆進(jìn)行序列測定和分析，發(fā)現(xiàn)其中14個與已知的基因具有較高的同源性，其中克隆Nb14-4編碼一個特異的ALY蛋白；克隆Nb14-56編碼普通煙

3、中的一種捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白；克隆Nb38(2)-59編碼一個核糖核蛋白RNP-1；克隆Nb3-9和Nb4-26分別編碼一個蘋果酸脫氫酶和果糖二磷酸醛縮酶；Nb4-28編碼普通煙中的14-3-3d-2蛋白。還有21個克隆在公共數(shù)據(jù)庫中沒有同源基因，提示可能是因克隆到的片段過小或數(shù)據(jù)庫中本氏煙EST序列不全造成的。上述結(jié)果表明，利用病毒表達(dá)載體建立cDNA文庫，采用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)可從煙草全基因組內(nèi)克隆受不同激發(fā)子誘導(dǎo)的過敏性細(xì)胞

4、死亡的調(diào)控基因，為揭示植物過敏性細(xì)胞死亡分子機(jī)制提供試驗依據(jù)。
　　 從本氏煙cDNA文庫中篩選到一個調(diào)控過敏性細(xì)胞死亡的基因NbALY916，該基因沉默能抑制Nepl誘導(dǎo)的HCD，減緩harpin誘導(dǎo)的HCD，但不影響INF1誘導(dǎo)的HCD;而本氏煙中其它的三個ALY基因（NbALY615、NbALY617和NbALY1693）分別沉默后不影響3種激發(fā)子誘導(dǎo)的HCD，表明NbALY916在調(diào)控激發(fā)子誘導(dǎo)的HCD過程中具有特異性。

5、NbALY916基因沉默削弱了激發(fā)子Nepl和harpin誘發(fā)的H2O2積累、抑制了它們誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細(xì)胞中NO的積累，但是對激發(fā)子INF1信號途徑卻沒有影響，同時不影響3種激發(fā)子誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累.表明NbALY916在不同激發(fā)子誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉及NO和H2O2積累中作用存在差異。與此同時，NbALY916沉默能抑制激酶MAPKKKα過表達(dá)所誘導(dǎo)的過敏性細(xì)胞死亡，抑制轉(zhuǎn)錄因子WRKY2的表達(dá)，但不影響MAPKKKα、MEK