棉疫病菌誘導(dǎo)非寄主過(guò)敏反應(yīng)激發(fā)子基因的克隆及功能研究.pdf

1、本文利用PVX病毒載體建立棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)的cDNA文庫(kù)，采用功能篩選策略克隆了能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的激發(fā)子基因(片段)。以農(nóng)桿菌Mogl01為宿主、利用PVX病毒表達(dá)載體構(gòu)建了含有6800個(gè)單克隆的棉疫病菌cDNA，采用牙簽接種本氏煙(Nicotiana benthamiana)，從4100個(gè)克隆中篩選到12個(gè)能引起煙草過(guò)敏反應(yīng)的陽(yáng)性克隆。對(duì)上述陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)與已知

2、的基因具有較高的同源性，其中克隆PBC413編碼一個(gè)特異的elicitin蛋白；克隆PBCl63編碼一個(gè)Rab蛋白，與大豆疫霉的RAB基因同源性較高；克隆PBC241編碼prohibitin蛋白；PBN62編碼一個(gè)熱激蛋白60(HSP60)。還有5個(gè)克隆在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有同源基因，提示可能是該病原茵特異的激發(fā)子基因。上述結(jié)果表明，利用病毒表達(dá)載體建立cDNA文庫(kù)采用功能篩選策略可從棉疫病菌全基因組范圍內(nèi)篩選誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生HR的激、發(fā)子基因

3、，該方法可望為其它植物病原菌激發(fā)子基因的克隆提供技術(shù)平臺(tái)。從棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)能引起煙草過(guò)敏反應(yīng)的elicitin基因，命名為Pbelicitin（Phytophthora boehmeriae elicltin)。經(jīng)SOUthem雜交分析表明，該基因在基因組中至少有5個(gè)拷貝。該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)野生型煙草Xanthi和不能積累乙烯的Tetre煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)和對(duì)TM

4、V與Phytophthora　nicotianae產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性，且能誘導(dǎo)這兩種煙草的PR-1α、PR-1b和PR-1c基因的表達(dá)，表明Pbelicitin誘導(dǎo)的HR和SAR受不依賴(lài)于乙烯的信號(hào)途徑控制；而該原核融合表達(dá)產(chǎn)物只能誘導(dǎo)不能積累水楊酸的轉(zhuǎn)nahG基因煙草NahG產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，不能誘導(dǎo)其PR-1α、PR-1b和PR-1c的表達(dá)，表明SA不參與該elicitin誘導(dǎo)的HR，而參與其誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗病性。并且在棉疫病菌與棉花親和

5、互作中Pbelicitin下調(diào)表達(dá)的。從棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)能引起煙草過(guò)敏反應(yīng)的RAB基因片段，根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)后，根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出了該基因的長(zhǎng)度為606bp的全長(zhǎng)序列，命名為PbRAB。經(jīng)southem雜交分析表明，該基因在基因組中是單拷貝的。PbRAB基因的原核表達(dá)產(chǎn)物處理野生型煙草Xanthi后，發(fā)現(xiàn)能夠作為效應(yīng)因子引起煙草的。HR反應(yīng)和H<,2>O<

6、,2>的積累，通過(guò)RT-PCR分析表明經(jīng)處理的煙草在過(guò)敏性壞死反應(yīng)過(guò)程中有PR基因的誘導(dǎo)表達(dá)。本試驗(yàn)還構(gòu)建了四個(gè)功能突變體，初步分析了引起過(guò)敏性壞死反應(yīng)的功能區(qū)域，并確認(rèn)了基因原核表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能與其第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(15.20位氨基酸)有關(guān)。本文還就棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)分泌的蛋白激發(fā)子PB90誘發(fā)不結(jié)球白 菜產(chǎn)生的H<,2>O<,2>在其誘發(fā)該植物過(guò)敏性細(xì)胞死亡和防衛(wèi)反應(yīng)中作用機(jī)制進(jìn)行了研究。首

7、先 建立了激發(fā)子PB90與不結(jié)球白菜新的植物．激發(fā)子互作系統(tǒng)，該激發(fā)子引起的細(xì)胞死亡與 哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡具有相似的形態(tài)學(xué)特征，如細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞核濃縮，表明該激發(fā) 子誘導(dǎo)不結(jié)球白菜細(xì)胞死亡是一個(gè)細(xì)胞凋亡過(guò)程。不結(jié)球白菜葉片經(jīng)激發(fā)子PB90處理后 能迅速提高體內(nèi)苯基丙氨酸解氨酶PAL的活性，同時(shí)誘導(dǎo)PR-l和Chistinase的增強(qiáng)表達(dá)， 且能夠誘導(dǎo)不結(jié)球白菜對(duì)炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum

8、)和大白菜軟腐病菌 (Erwinia carotovora var．carotovora)等病原菌產(chǎn)生抗性。不結(jié)球白菜葉片經(jīng)激發(fā)子PB90注 射處理大約3 h后出現(xiàn)H<,2>O<,2>的積累，而激發(fā)子處理引起的細(xì)胞死亡在12 h出現(xiàn)。在激發(fā)子 處理前30 rain先注射抗氧化劑(DTT，glutathione和ascorbic acid)和DPI(NADPH氧化酶抑制 劑)，能顯著抑制PB90引起的細(xì)胞死亡和PR-I與Chiti