棉疫病菌誘導非寄主過敏反應激發(fā)子基因的克隆及功能研究.pdf

1、本文利用PVX病毒載體建立棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)的cDNA文庫，采用功能篩選策略克隆了能誘導煙草產生過敏反應的激發(fā)子基因(片段)。以農桿菌Mogl01為宿主、利用PVX病毒表達載體構建了含有6800個單克隆的棉疫病菌cDNA，采用牙簽接種本氏煙(Nicotiana benthamiana)，從4100個克隆中篩選到12個能引起煙草過敏反應的陽性克隆。對上述陽性克隆進行序列測定和分析，發(fā)現其中7個與已知

2、的基因具有較高的同源性，其中克隆PBC413編碼一個特異的elicitin蛋白；克隆PBCl63編碼一個Rab蛋白，與大豆疫霉的RAB基因同源性較高；克隆PBC241編碼prohibitin蛋白；PBN62編碼一個熱激蛋白60(HSP60)。還有5個克隆在公共數據庫中沒有同源基因，提示可能是該病原茵特異的激發(fā)子基因。上述結果表明，利用病毒表達載體建立cDNA文庫采用功能篩選策略可從棉疫病菌全基因組范圍內篩選誘導煙草產生HR的激、發(fā)子基因

3、，該方法可望為其它植物病原菌激發(fā)子基因的克隆提供技術平臺。從棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文庫中篩選到一個能引起煙草過敏反應的elicitin基因，命名為Pbelicitin（Phytophthora boehmeriae elicltin)。經SOUthem雜交分析表明，該基因在基因組中至少有5個拷貝。該基因的原核表達產物能誘導野生型煙草Xanthi和不能積累乙烯的Tetre煙草產生過敏反應和對TM

4、V與Phytophthora　nicotianae產生系統(tǒng)獲得抗性，且能誘導這兩種煙草的PR-1α、PR-1b和PR-1c基因的表達，表明Pbelicitin誘導的HR和SAR受不依賴于乙烯的信號途徑控制；而該原核融合表達產物只能誘導不能積累水楊酸的轉nahG基因煙草NahG產生過敏反應，不能誘導其PR-1α、PR-1b和PR-1c的表達，表明SA不參與該elicitin誘導的HR，而參與其誘導的系統(tǒng)獲得抗病性。并且在棉疫病菌與棉花親和

5、互作中Pbelicitin下調表達的。從棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文庫中篩選到一個能引起煙草過敏反應的RAB基因片段，根據公共數據庫序列比對后，根據同源序列設計引物，擴增出了該基因的長度為606bp的全長序列，命名為PbRAB。經southem雜交分析表明，該基因在基因組中是單拷貝的。PbRAB基因的原核表達產物處理野生型煙草Xanthi后，發(fā)現能夠作為效應因子引起煙草的。HR反應和H<,2>O<

6、,2>的積累，通過RT-PCR分析表明經處理的煙草在過敏性壞死反應過程中有PR基因的誘導表達。本試驗還構建了四個功能突變體，初步分析了引起過敏性壞死反應的功能區(qū)域，并確認了基因原核表達產物發(fā)揮功能與其第一個跨膜結構域(15.20位氨基酸)有關。本文還就棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)分泌的蛋白激發(fā)子PB90誘發(fā)不結球白 菜產生的H<,2>O<,2>在其誘發(fā)該植物過敏性細胞死亡和防衛(wèi)反應中作用機制進行了研究。首

7、先 建立了激發(fā)子PB90與不結球白菜新的植物．激發(fā)子互作系統(tǒng)，該激發(fā)子引起的細胞死亡與 哺乳動物的細胞凋亡具有相似的形態(tài)學特征，如細胞膜皺縮、細胞核濃縮，表明該激發(fā) 子誘導不結球白菜細胞死亡是一個細胞凋亡過程。不結球白菜葉片經激發(fā)子PB90處理后 能迅速提高體內苯基丙氨酸解氨酶PAL的活性，同時誘導PR-l和Chistinase的增強表達， 且能夠誘導不結球白菜對炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum

8、)和大白菜軟腐病菌 (Erwinia carotovora var．carotovora)等病原菌產生抗性。不結球白菜葉片經激發(fā)子PB90注 射處理大約3 h后出現H<,2>O<,2>的積累，而激發(fā)子處理引起的細胞死亡在12 h出現。在激發(fā)子 處理前30 rain先注射抗氧化劑(DTT，glutathione和ascorbic acid)和DPI(NADPH氧化酶抑制 劑)，能顯著抑制PB90引起的細胞死亡和PR-I與Chiti