細(xì)胞非整倍性畸變發(fā)生機(jī)制研究.pdf

1、人類多種遺傳病和腫瘤的發(fā)生均與細(xì)胞染色體非整倍性畸變相關(guān)。染色體分離行為主要由動(dòng)粒(Kinetochore)和紡錘體檢查點(diǎn)(Spindleassemble checkpoint,SAC)等功能結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制所調(diào)控。本研究將從kinetochore上DNA分子突變和蛋白復(fù)合物變異兩個(gè)角度來(lái)探討細(xì)胞非整性畸變的發(fā)生機(jī)制。
　　 Kinetochore位于染色體著絲粒區(qū),是由著絲粒蛋白(CENPs)和α衛(wèi)星DNA共同組成的三層盤狀結(jié)構(gòu)

2、[1],是支持染色體分離的重要元件。在細(xì)胞分裂過(guò)程中,染色體的移動(dòng)、姐妹染色單體分離都通過(guò)附著在kinetochore上的紡錘絲牽引來(lái)完成。Kinetochore的缺失或者其上的結(jié)構(gòu)、成分發(fā)生變化,均可導(dǎo)致紡錘絲的附著失敗或者附著不均一,進(jìn)而引起染色體分離行為的異常。
　　 Kinetochore上的CENPs的功能一直受到人們的關(guān)注,CENPs表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常,將影響kinetochore的組裝、激活、自我復(fù)制等,并對(duì)染色體的正

3、常分離產(chǎn)生影響。CENP-B是著絲粒蛋白家庭中關(guān)鍵蛋白之一,它通過(guò)與著絲粒區(qū)α衛(wèi)星DNA序列上特定的17bp序列(稱為CENP-B框)結(jié)合而行使功能。已有研究證實(shí):具有功能活性的著絲粒需要完整的CENP-B框與CENP-B蛋白結(jié)合,兩者缺一不可,并且兩者的結(jié)合能力對(duì)CENP-A、CENP-C和CENP-E在著絲粒的聚集起著主導(dǎo)作用。因此,結(jié)構(gòu)完整的CENP-B框?qū)τ贑ENP-B蛋白行使其在kinetochore上的各種功能,以及kine

4、tochore在細(xì)胞分裂中是否正常發(fā)揮其功效起著決定性的作用。
　　 通過(guò)特殊的銀染色方法或抗著絲?？贵w間接免疫熒光技術(shù),可以清晰顯示染色體著絲粒區(qū)Kinetochore蛋白復(fù)合體(即kinetochore-CENPs復(fù)合體),其結(jié)構(gòu)和成分的變異勻可影響kinetochore的功能?，F(xiàn)已證實(shí)Kinetochore蛋白復(fù)合體上蛋白分子(CENPs)缺乏是誘發(fā)染色體不分離的潛在根源[3]。
　　 本研究從染色體著絲粒區(qū)α衛(wèi)星

5、DNA上CENP-B框突變的角度,探索唐氏綜合征患兒21號(hào)染色體不分離的分子基礎(chǔ)。此外,利用kinetochore-NOR同步銀染技術(shù)分析惡性腫瘤細(xì)胞(HEP-2、SW626)Kinetochore蛋白復(fù)合體變異,以探討惡性腫瘤細(xì)胞染色體非整倍性畸變發(fā)生的因?yàn)?。本?shí)驗(yàn)將會(huì)為進(jìn)一步探索細(xì)胞非整倍性畸變發(fā)生機(jī)制奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第一部分：
　　 目的:
　　 分析Down's患兒和正常兒童21號(hào)染色體著絲粒

6、區(qū)αI型衛(wèi)星DNA(Accession:D29750)上4個(gè)CENP-B框及其臨近序列是否存在變異,以及這些變異是否與Down’s患兒21號(hào)染色體不分離存在一定關(guān)系。
　　 方法:
　　 提取150例Down’s患兒和100例正常兒童外周血DNA,分兩段PCR擴(kuò)增21號(hào)染色體著絲粒區(qū)αI型衛(wèi)星序列(覆蓋4個(gè)CENP-B框),所得產(chǎn)物采用專門設(shè)計(jì)的測(cè)序引物直接測(cè)序,并采用DNAssist2.0軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上序列進(jìn)行

7、對(duì)比。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功提取150例Down's患兒和100例正常兒童外周血DNA,瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示DNA片斷完整,純度高。
　　 2.完成21號(hào)染色體著絲粒區(qū)αI型衛(wèi)星DNA的PCR分段擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物條帶分明,無(wú)錯(cuò)誤擴(kuò)增片段。
　　 3.完成所有標(biāo)本21號(hào)染色體著絲粒區(qū)αI型衛(wèi)星DNA的分段測(cè)序,測(cè)序圖譜上4個(gè)CENP-B框序列完整,清晰,無(wú)雜峰。

8、>　　 4.所得結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn):①Down’s患兒和正常兒童的CENP-B框序列高度保守；②所有患者和正常人的αI型衛(wèi)星DNA區(qū)段的部分位點(diǎn)和NCBI公布的標(biāo)準(zhǔn)序列存在差異,主要為:661位點(diǎn)C缺失,670位點(diǎn)T→G,1035和1036位點(diǎn)之間插入A,1076和1077位點(diǎn)之間插入C,1239位點(diǎn)A→T,1343位點(diǎn)T→C；③在αI型衛(wèi)星DNA上發(fā)現(xiàn)大量國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道的SNPs位點(diǎn)。
　　 結(jié)論:
　

9、　 1.染色體著絲粒區(qū)αI型衛(wèi)星DNA是一類高度重復(fù)的非編碼序列,這類高度重復(fù)的非編碼序列對(duì)維持DNA序列保守起到了保護(hù)作用。雖然體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),人工合成帶有突變的CENP-B框不能與CENP-B蛋白結(jié)合而影響動(dòng)粒蛋白復(fù)合體的形成,但我們?cè)谥袊?guó)人群Down’s患兒和正常兒童染色體著絲粒區(qū)的CENP-B框勻未檢測(cè)到。DNA突變,這表明這類高度重復(fù)的非編碼序列的存在能夠有效抑制CENP-B框DNA突變而預(yù)防染色體非整倍性畸變的發(fā)生。因此,我

10、們認(rèn)為人類Down’s患兒21號(hào)染色體不分離的分子基礎(chǔ)可能不涉及CENP-B框DNA突變。
　　 2.我們?cè)谥袊?guó)人的αI類衛(wèi)星DNA區(qū)段檢出了多個(gè)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的標(biāo)準(zhǔn)序列不一致的位點(diǎn),這可能與種族差異有關(guān)。此外,我們還在αI類衛(wèi)星DNA上發(fā)色體不分現(xiàn)大量尚未見(jiàn)報(bào)道的SNPs位點(diǎn),這些SNPs的意義何在,尚不清楚。
　　 第二部分：
　　 目的:
　　 分析HEP-2和SW626兩種惡性腫瘤細(xì)胞染色體

11、Kinetochore蛋白復(fù)合體變異情況,以探討染色體非整倍體畸變的發(fā)生因?yàn)椤?br>　　 方法:
　　 采用改良的kinetochore-NOR同步銀染技術(shù)分析HEP-2細(xì)胞和SW626細(xì)胞染色體Kinetochore蛋白復(fù)合體變異,正常健康人外周血細(xì)胞作為對(duì)照,惡性腫瘤細(xì)胞與正常健康人外周血細(xì)胞Kinetochore蛋白復(fù)合體變異比較分析采用卡方檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.分析HEP-2細(xì)胞株染色體分裂

12、相308個(gè),共計(jì)染色體16962條:檢出kinetochore缺失染色體146條、kinetochore-NOR融合染色體105條、kinetochore遲滯復(fù)制染色體78條、不對(duì)稱kinetochore染色體38條、多重kinetochore染色體18條。
　　 2.分析SW626細(xì)胞株染色體分裂相334個(gè),共計(jì)染色體12092條:檢出kinetochore缺失染色體325條、kinetochore-NOR融合染色體243條、

13、不對(duì)稱kinetochore染色體15條、多重kinetochore染色體8條、kinetochore遲滯復(fù)制染色體28條。
　　 3.分析正常人外周血淋巴細(xì)胞分裂相367個(gè),共計(jì)染色體16882條:檢出kinetochore缺失染色體42條、kinetochore-NOR融合染色體85條、不對(duì)稱kinetochore染色體4條、kinetochore遲滯復(fù)制染色體29條。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析表明:與正常健康人外周血細(xì)胞

14、比較,①HEP-2細(xì)胞染色體kinetochore缺失、kinetochore遲滯復(fù)制、不對(duì)稱kinetochore和多重kinetochore發(fā)生率顯著升高(P<0.01),kinetochore-NOR融合率二者之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；② SW6262細(xì)胞染色體kinetochore缺失、kinetochore-NOR融合不對(duì)稱、kinetochore和多重kinetochore發(fā)生率顯著升高(P<0.01),kineto

15、chore遲滯復(fù)制二者之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HEP-2和SW626細(xì)胞染色體的Kinetochore蛋白復(fù)合體均存在不同程度的變異,這種變異可能是腫瘤細(xì)胞染色體非整倍性畸變的潛在根源。
　　 2.①HEP.2細(xì)胞染色體非整倍性突變可能源于kinetochore缺失、kinetochore遲滯復(fù)制、不對(duì)稱kinetochore和多重kinetochore；②SW626細(xì)胞染色體