神經(jīng)營養(yǎng)因子-3基因修飾的雪旺細胞對神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷臨床療效常常不能令人滿意。近年來，雪旺細胞(Schwanncells，SCs)對神經(jīng)系統(tǒng)的作用開始引起學者們的重視。Rathbone 等在實驗研究中發(fā)現(xiàn)：SCs是周圍神經(jīng)基因治療理想的受體細胞，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后，SCs 對再生軸突具有誘向作用，并有較強的維持神經(jīng)元存活，促進軸突的生長、神經(jīng)再生的作用。并通過自分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors NTs)維持存活，神經(jīng)營養(yǎng)因子能促進發(fā)育中的交

2、感和感覺神經(jīng)細胞的分化和成熟，維持交感神經(jīng)元正常功能，促進該神經(jīng)元突起的長出，并誘導突起向神經(jīng)纖維生長。
　　 特別是神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factor 3 NT-3)，能夠維持肌梭、肌腱和皮膚傳入感覺神經(jīng)元的存活，增加運動神經(jīng)元再生，促進神經(jīng)肌突觸的成熟，增加再生軸突的數(shù)量和長度，防止神經(jīng)損傷后肌肉萎縮。在周圍神經(jīng)損傷再生過程中有非常重要作用。但NT-3在體內不穩(wěn)定，極易被稀釋或降解失活，吸收率不高，在臨床應

3、用上效能較低。SCs 有時效局限。本實驗為了提高NT-3和雪旺細胞促進神經(jīng)再生的活性、減少局限性，將NT-3基因轉入雪旺細胞，觀察其表達。為了初步探討其作用，故設計本實驗。
　　 首先我們培養(yǎng)、分離、純化雪旺細胞。先將出生后3d的Wistar大鼠坐骨神經(jīng)，經(jīng)雙酶消化后的剩余組織塊采用植塊法培養(yǎng)雪旺細胞，混懸于DMEM 培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱。3ｄ后首次換液，以后7ｄ換液1 次。細胞80[％]融合時，雙差速貼壁法G-

4、418(geneticin)純化雪旺細胞。然后再培養(yǎng)24h。
　　 相差顯微鏡下觀察計數(shù)，繪制各自的增殖曲線。在不同時間對雪旺細胞進行流式細胞分析、免疫組化S-100蛋白染色鑒定、四氮唑鹽(MTT)比色法測定細胞的生長增殖情況。結果發(fā)現(xiàn)：胰酶和膠原酶混合消化后的雪旺細胞活細胞率為94.6±3.4[％]，經(jīng)免疫組化S-100 法鑒定純化后的雪旺細胞純度為95.6±2.5[％]。
　　 差異有非常顯著性意義(P<0.01)。

5、說明周圍神經(jīng)中存在大量雪旺細胞，這些細胞能在體外進行分離培養(yǎng)，能獲取量大純度高、活力良好的雪旺細胞。胰酶和膠原酶混合消化結合差速貼壁法和G418 純化，可得到較高純度和較多數(shù)量的雪旺細胞。這是一種簡便有效的雪旺細胞培養(yǎng)、純化的方法。
　　 在第二部分，我們先將NT-3 質粒提取、鑒定和純化；采用陽離子脂質體介入法，將脂質體轉染酶介導的NT-3 轉染至已培養(yǎng)好的雪旺細胞，轉染后的雪旺細胞經(jīng)G418 篩選，獲得成功轉染NT-3基因的

6、SCs 克隆。觀察NT-3蛋白的表達，鏡下測定轉染率，收集不同階段的無血清培養(yǎng)液，通過免疫組化和RT-PCR 結果測定樣本中NT-3 含量。采用免疫組化和逆轉錄酶-多聚酶鏈反應(RT-PCR)方法進行鑒定，并對RT-PCR 產(chǎn)物測序，進一步證實NT-3的存在；用限制性內切酶酶切質粒后瓊脂糖電泳鑒定；ELISA 雙抗體夾心法檢測NT-3的表達；經(jīng)過G418的多次篩選，并經(jīng)Gimsa 染色、免疫組化S-100 法鑒定SCs的純度。結果顯示：

7、
　　 經(jīng)Gimsa 染色、免疫組化S-100 法鑒定SCs的純度達95％以上。轉染后雪旺細胞最突出的表現(xiàn)是胞體多呈長梭形，胞漿豐富，核卵圓形，可見到豐富的粗面內質網(wǎng)、線粒體和發(fā)育良好的高爾基體。ELISA 雙抗體夾心法測定轉染后不同時期的NT-3的濃度：1周開始表達，2周后表達增加，4周后明顯增加，差異有非常顯著性意義(P<0.01)。所以，NT-3基因可轉入培養(yǎng)的SCs 并高效表達。SCs作為受體細胞，易于獲取并能在體外大量

8、培養(yǎng)繁殖；能較長時間表達所攜帶基因而不衰減，并能穩(wěn)定大量地表達。
　　 為了進一步探討神經(jīng)營養(yǎng)因子3基因修飾的雪旺細胞對周圍神經(jīng)再生修復的影響，從轉基因角度探討治療周圍神經(jīng)損傷的有效方法，我們在第三部分設計NT-3基因修飾的雪旺細胞修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損觀察其對促進神經(jīng)再生的影響。我們選用96 只SD大鼠，于右側梨狀肌下緣以遠8mm切斷并切除遠斷端10mm長的神經(jīng)干保持10mm的缺損，制成坐骨神經(jīng)缺損模型，應用NT-3基因修飾的雪

9、旺細胞結合細胞外基質凝膠及生物可降解聚乳酸聚羥基乙酸共聚物管(PLGA)構建的神經(jīng)移植復合體，修復大鼠坐骨神經(jīng)的缺損。將坐骨神經(jīng)切斷缺損模型大鼠按橋接物的不同隨機分為4組，每組24 只。A組：細胞外基質凝膠PLGA 管橋接組；B組：雪旺細胞-細胞外基質凝膠PLGA 管橋接組；C組：NT-3基因-細胞外基質凝膠PLGA 管橋接組；D組：NT-3基因修飾的雪旺細胞-細胞外基質凝膠PLGA 管橋接組。術后1周、4周、8周、12周進行運動神經(jīng)傳

10、導速度、軸突數(shù)、髓鞘的厚度、神經(jīng)纖維的直徑、神經(jīng)組織面積的百分比和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve functional index SFI)等檢測，發(fā)現(xiàn)D組均優(yōu)于B、C組，B、C組均優(yōu)于A組(P<0.01)，而B、C組相比無明顯差異(P>0.05)。因此，轉染NT-3基因的雪旺細胞移植于損傷的周圍神經(jīng)，有促進神經(jīng)生長、髓鞘再生的作用，使局部釋放的NT-3 加快軸突再生速度以促進周圍神經(jīng)再生，減緩失神經(jīng)支配肌肉的萎縮，能彌補

11、單純細胞移植、神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的不足。
　　 綜合我們的試驗，結合參閱文獻，我們認為：(1)胰酶和膠原酶混合消化結合差速貼壁法和G418 純化，可得到較高純度和較多數(shù)量的雪旺細胞。這是一種簡便有效的雪旺細胞培養(yǎng)、純化的方法。(2)NT-3基因可轉入培養(yǎng)的SCs 并高效表達。SCs作為受體細胞，易于獲取并能在體外大量培養(yǎng)繁殖；能較長時間表達所攜帶基因而不衰減，并能穩(wěn)定大量地表達。(3)轉染NT-3基因的雪旺細胞移植于損傷的周圍神經(jīng)